Karakteristik penempelan dan koagregasi bakteri

METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Ternak.
Bagian Teknologi Hasil Ternak, laboratorium lapang Pemuliaan dan Genetika,
Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan,
Fakultas Peternakan serta Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi, Fisiologi
dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian
dilaksanakan mulai bulan Mei sampai November 2010.
Materi
Bahan yang digunakan berupa kultur bakteri asal dadiah yaitu Lactobacillus
plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01 dan asal yogurt susu sapi Lactobacillus
acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01. Semua kultur bakteri tersebut
merupakan koleksi dari laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak,
Fakultas Peternakan, IPB. Kultur ditumbuhkan pada media MRSB (de-Man’s
Ragosa Sharpe Broth). Pengujian penempelan bakteri menggunakan usus tikus
percobaan yaitu pada bagian usus halus tikus putih (Rattus novergicus) strain
Sprague Dawley. Tikus yang digunakan adalah tikus jantan dengan bobot hidup ratarata 120-130 gram. Pengujian penempelan bakteri pada permukaan padat dilakukan
dengan menggunakan media pelat stainless steel. Bahan-bahan media yang
digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah larutan PBS (Phosphat Buffer
Saline), formalin, larutan alkohol 70%, 80%, 90% dan 95%, parafin, de-Man’s
Rogosa Sharpe Broth (MRSB), Buffer Pepton Water (BPW), de-Man’s Rogosa
Sharpe Agar (MRSA), mounting media dan Hematoxilin-Eosin. Media untuk
pengujian penempelan pada permukaan padat yaitu larutan detergen (SDS) 1%,
aquades dan larutan acridin orange 0,026%.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah inkubator,
waterbath, vortex, sentrifuse, tabung reaksi, mikropipet, lemari es, jangka sorong,
gelas ukur, pemanas Bunsen, spektrofotometer, timbangan digital, sendok pengaduk,
oven, autoklaf, pH meter, kamera, mikrotom, gunting, gelas objek, kandang koloni
tikus, tempat minum dan pakan tikus, pelat stainless steel (SS), mikroskop cahaya,
mikroskop epifluoresen serta kamera.
Prosedur
Penelitian ini dibagi dalam dua tahap. Tahap pertama merupakan penelitian
pendahuluan serta tahap kedua merupakan penelitian utama. Diagram alir penelitian
yang dilakukan secara garis besar dapat dilihat pada gambar 6.
Persiapan BAL indigenous dadiah dan asal
yogurt susu sapi
(pewarnaan Gram dan uji katalase)
Penelitian
Pembuatan kurva standar dengan metode
Pendahuluan
turbidimetri
Persiapan sampel usus tikus
Persiapan pelat stainless steel
Uji agregasi
Uji autoagregasi
Uji koagregasi
Uji penempelan BAL pada
Penelitian Utama
permukaan usus tikus secara in vitro
Uji penempelan BAL pada permukaan
Stainless steel secara in vitro
menempel
Probiotik
tidak menempel
Bukan probiotik
Gambar 6. Diagram Alir Penelitian
20
Penelitian Pendahuluan
Persiapan Bakteri Asam Laktat Indigenous Dadiah dan Yogurt Susu Sapi
(Pelczar dan Chan, 2007). Penelitian pendahuluan meliputi: persiapan bakteri asam
laktat yang digunakan dalam pengujian agregasi, autoagregasi, koagregasi dan
penempelan terhadap usus tikus (in vitro) dan penempelan pada pelat stainless steel.
Bakteri uji yang digunakan yaitu Lactobacillus plantarum D-01, Lactococcus lactis
D-01, Lactobacillus acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01. Karakteristik berupa morfologi dan sifat katalase diperiksa untuk konfirmasi kemurnian bakteri
asam laktat yang digunakan.
Pengamatan morfologi bakteri dilakukan melalui pewarnaan Gram (Pelczar
dan Chan, 2007). Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara bakteri asam laktat kultur
muda (24 jam) diambil satu mata jarum Öse, kemudian dioleskan pada gelas objek.
Gelas objek tersebut difiksasi (dilewatkan diatas api Bunsen), lalu ditetesi larutanlarutan dengan urutan berikut: ungu kristal (UK), larutan yodium, alkohol 95%
(bahan pemucat) dan safranin. Bakteri yang telah diwarnai dicuci dari sisa pewarna
dan dikeringkan, kemudian diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran
100x dengan bantuan minyak imersi. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini
dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram positif, bila bakteri dapat
mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok
yang lain yaitu bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah, karena pada saat
dicuci dengan alkohol tidak dapat mempertahankan warna ungu sehingga sewaktu
diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin bakteri menyerap warna
tersebut dan tampak berwarna merah.
Selain dilihat morfologinya, konfirmasi kemurnian dari bakteri asam laktat
dapat melalui uji katalase. Uji katalase dilakukan dengan mengambil satu mata jarum
Öse koloni bakteri dari stok kultur, kemudian dioleskan pada gelas objek. H2O2
diteteskan pada preparat bakteri tersebut kemudian diamati keberadaan gelembung
udara (O2) yang timbul setelah bakteri ditetesi H2O2 tersebut. Contoh tahapan uji
katalase dapat dilihat pada Gambar 7a. Uji katalase dikatakan positif bila terjadi
gelembung udara (O2), sedangkan dikatakan negatif bila tidak terjadi gelembung
udara (Gambar 7b).
21
gelembung udara
Negatif
Positif
(a)
(b)
Gambar 7. (a) Tahapan Uji Katalase, (b) Contoh Hasil Uji Katalase
Sumber: Pradhika (2010)
Pembuatan Kurva Standar dengan Metode Turbidimetri (Waluyo, 2008).
Kurva standar penting untuk mendapatkan jumlah populasi bakteri uji yang
digunakan. Kurva standar ditentukan melalui persamaan y = ax + b, yang merupakan
persamaan antara optical density (nilai absorbansi) yang diukur dengan
spektrofotometer dan jumlah populasi bakteri uji yang diperoleh dengan metode
pemupukan. Persamaan ini di dapat dengan melakukan pengenceran (P) bakteri uji
pada P0, P1/2, P1/4, P1/8, P1/16 dan P1/32 yang kemudian sampel dari masingmasing pengenceran diukur nilai OD (Optical Density) dengan panjang gelombang
620 nm serta populasi berdasarkan hasil pemupukan. Korelasi antara masing-masing
nilai OD dan populasi dari pemupukan ditentukan berdasarkan persamaan y = ax + b.
Persamaan yang didapat berguna untuk penentuan jumlah populasi bakteri uji atau
untuk standarisasi bakteri uji yang akan digunakan. Korelasi OD dan populasi bakteri
asam laktat dalam pembuatan kurva standar dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Korelasi OD dan Populasi dalam Pembuatan Kurva Standar
Pengenceran
P0
P1/2
P1/4
P1/8
P1/16
P1/32
OD (x)
x1
x2
x3
x4
x5
x6
Populasi (y)
y1
y2
y3
y4
y5
y6
22
Korelasi antara nilai OD dan populasi akan menghasilkan persamaan linier
populasi bakteri (log cfu/ml)
seperti tampak pada Gambar 8.
y66
y= ax + b
y55
y44
y33
y2
2
y1
1
x1
1
x2
2
3x3
4x4
5x5
6x6
OD (nm)
Gambar 8. Korelasi Kurva Standar dengan Metode Turbidimetri
Setiap bakteri memiliki persamaan yang berbeda-beda karena tiap bakteri
memiliki karakteristik yang berbeda-beda pula. Standarisasi populasi bakteri dapat
diperoleh dari persamaan tersebut dengan memasukan nilai OD (Optical density)
pada persamaan y = ax + b, dengan x adalah nilai OD, a dan b merupakan konstanta
dari persamaan yang didapatkan dari hasil korelasi antara nilai OD dan nilai
populasi, sehingga didapatkan nilai y yang merupakan populasi standar dari bakteri
tersebut dengan satuan Log10 CFU/ml. Persamaan dari masing-masing BAL
indigenous dadiah dan asal yogurt susu sapi dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Persamaan BAL Berdasarkan Kurva Standar
BAL Indigenous Dadiah
Persamaan dari Kurva Standar
Koefisien
dan Yogurt Susu Sapi
(y = ax + b)
Determinan (R2)
L. plantarum D-01
y = 2,522x + 6,873
R² = 0,978
L. lactis D-01
y = 1,169x + 7,074
R² = 0,936
L. acidophilus Y-01
y = 1,812x + 7,2
R² = 0,976
B. longum Y-01
y = 1,093x + 6,684
R² = 0,957
23
Persamaan kurva standar diatas hanya dapat digunakan pada penggunaan
media dan kondisi penelitian yang sama dengan kondisi penelitian saat pembuatan
kurva standar tersebut. Masing-masing bakteri memiliki persamaan kurva standar
yang berbeda-beda. Pengujian yang memiliki kondisi berbeda tidak dapat menggunakan persamaan kurva standar yang sama.
Rahman (1992) menyatakan bahwa pengukuran optical density (OD) pada
batas tertentu, jumlah sinar yang diserap pada contoh cairan kultur akan sebanding
dengan konsentrasi sel. Jika dibuat kurva kalibrasi antara OD dengan jumlah bakteri
yang diketahui dalam suatu suspensi bakteri, akan dapat dihitung massa bakteri per
unit volume. Waluyo (2008) menambahkan bahwa pengukuran massa sel secara
langsung dapat dilakukan dengan mengukur kekeruhan biakan dengan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar teknik perhitungan ini adalah banyaknya cahaya
yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya sel mikroba pada batas-batas tertentu.
Data yang diperoleh dari pengukuran spektrofotometer dinyatakan dalam konsentrasi
mikroba, diperlukan suatu kurva standar yang menyatakan korelasi antara kekeruhan
biakan dengan jumlah organisme per ml biakan. Kurva dapat diperoleh dengan
menggunakan metode hitungan cawan untuk menentukan jumlah organisme di dalam
biakan yang kekeruhannya diketahui. Setelah kurva standar diperoleh, maka
sejumlah besar biakan organisme sejenis dengan cepat diukur kekeruhannya dan
konsentrasinya segera diketahui dengan membaca kurva.
Persiapan Sampel Usus Tikus. Pengujian penempelan (adesi) bakteri kandidat
probiotik dilakukan secara in vitro yaitu dengan mengamati penempelannya pada
usus tikus, sehingga diperlukan sampel usus tikus. Sampel usus tikus harus bebas
dari bakteri asal saluran pencernaan tikus tersebut, maka terhadap tikus-tikus yang
dipelihara diberikan perlakuan awal yaitu dengan dicekok antibiotik (amoksisilin)
selama lima hari pertama. Antibiotik dicekokan sebanyak 0,2 ml per hari dengan
dosis 5 mg/0,2 ml. Pada hari ke-6 sampai hari ke-11 pemberian antibiotik dihentikan
dan hanya diberi pakan yaitu berupa pelet starter broiler dengan kadar pemberian 30
gram/ekor/hari. Penghentian pemberian antibiotik beberapa hari sebelum hewan
dibedah dimaksudkan untuk menghilangkan tertimbunnya residu antibiotik dalam
jaringan (Priyono, 2008).
24
Sampel usus tikus didapat dengan membedah tikus putih yang sebelumnya
telah dianastesi, dengan menyuntikkan cairan pembius pada tikus. Setelah tikus
pingsan baru dilakukan pembedahan. Pembedahan dilakukan dengan membuka kulit
bagian perut dan mengambil saluran pencernaan bagian usus halus. Andra (2006)
menyatakan bahwa fungsi utama usus halus adalah tempat berlangsung absorbsi
mikronutrien, mineral dan vitamin. Oleh karena itu, pelekatan bakteri probiotik
penting untuk mendukung fungsi usus tersebut dengan menghambat penempelan
bakteri patogen yang bersifat merugikan sehingga fungsi penyerapan zat nutrien
dapat dimaksimalkan. Proses persiapan sampel usus halus tikus dapat dilihat pada
Gambar 9.
a
b
c
Gambar 9. Proses Adaptasi dan Pengambilan Sampel Usus Tikus (a) Pemeliharaan
Selama Pemberian Antibiotik, (b) Pemingsanan Tikus, (c) Pembedahan
dan Pengambilan Sampel Usus Tikus
Persiapan Pelat Stainless Steel. Pengujian penempelan bakteri pada permukaan
padat menggunakan media stainless steel. Sebelum digunakan, pelat stainless steel
(SS) terlebih dahulu perlu ditandai dan dibersihkan dari kotoran yang mungkin
menempel pada permukaannya. Pelat SS dibilas dengan air destilata kemudian
direndam kembali dalam larutan detergen (SDS) 1% suhu 40-450C selama 1 jam,
dibilas dengan air destilata sebanyak 2 kali dan dikeringkan. Pengeringan dilakukan
di udara terbuka dengan dialasi kertas saring (Dewanti dan Wong, 1995). Pelat SS
kemudian dimasukan ke dalam botol jar dan disterilisasi dengan autoklaf 121 0C
selama 20 menit.
Penelitian Utama
Uji Agregasi (Jankovic et al., 2003). Uji agregasi dilakukan untuk mengetahui
kemampuan suatu bakteri untuk membentuk koloni (agregat). Pada uji ini bakteri uji
(Lactobacillus plantarum D-01, Lactococcus lactis D-01, Lactobacillus acidophilus
25
Y-01 dan Bifidobacterum longum Y--01) ditumbuhkan pada MRSB (Oxoid, CM
0359) selama 24 jam pada suhu 37°C. Agregasi dinilai positif jika pada MRSB
didapatkan agregat yang jelas (partikel seperti pasir) membentuk endapan di dasar
tabung dan supernatan akan terlihat jernih. Populasi sebelum diinkubasi dan populasi
setelah diinkubasi dihitung untuk melihat adanya pertumbuhan bakteri asam laktat
yang diuji. Perhitungan populasi dilakukan dengan mengukur nilai OD (Optical
Density).
Uji Autoagregasi (Kost et al ., 2003). Uji autoagregasi dilakukan untuk menentukan
besarnya kemampuan interaksi bakteri antara sesamanya. Pada pengujian
autoagregasi bakteri ditumbuhkan pada MRSB selama 18 jam pada suhu 37 0C. Sel
dipanen dengan disentrifugasi pada 5000 g selama 15 menit, dicuci dua kali dan
dibuang cairannya (supernatan) sehingga tertinggal pelet (padatannya) kemudian
dimasukan ke dalam larutan PBS dengan pH 7.2 dan diamati nilai absorbansinya
dengan spektrofotometer sampai kekeruhan tertentu yang dicerminkan dengan nilai
OD (Optical Density) yang menunjukan bahwa jumlah populasi tersebut sebanyak
108 CFU/ ml. Penentuan jumlah populasi berdasarkan OD menggunakan persamaan
yang terbentuk untuk masing-masing bakteri. Suspensi sel dihomogenkan dengan
vortex selama 10 detik dan autoagregasi kultur BAL ditentukan selama 5 jam yang
diinkubasi pada suhu ruang (27 + 0,5oC). Setiap satu jam, diambil sampel sebanyak 2
ml dan diperiksa nilai absorbansi (A 620 nm). Pengambilan sampel dilakukan
sebanyak 3 kali ulangan dan duplo. Persentase autoagregasi dapat dihitung sebagai 1(At/A0) x 100, dengan At adalah nilai absorbansi pada t = 1, 2, 3, 4 atau 5 jam dan A0
adalah nilai absorbansi pada t = 0.
Uji Koagregasi (Kost et al., 2003). Uji koagregasi dilakukan untuk menentukan
besarnya kemampuan interaksi antar kultur bakteri untuk saling menempel, sehingga
tidak mudah tercuci keluar akibat pergerakan usus. Uji koagregasi ditentukan
berdasarkan pada penurunan nilai OD (optical density) relatif antara bakteri yang
dicampur dengan yang tidak dicampur (tunggal). Metode ini menggunakan kultur
tunggal dan campuran dengan perbandingan 1:1. Metode persiapan suspensi bakteri
sama dengan pengujian autoagregasi yaitu sebanyak 2 ml dari setiap suspensi BAL
yang uji dicampur (BAL x + BAL y) dan dihomogenkan dengan vortex selama 10
26
detik. Tabung kontrol yang berisi 4 ml dari setiap suspensi BAL yang diuji
dipersiapkan untuk diamati nilai absorbansinya. Nilai absorbansi (A) diamati pada
620 nm dari suspensi diukur setelah dua bakteri uji dicampur dan setelah 5 jam di
inkubasi pada suhu ruangan. Sampel diambil dengan cara yang sama seperti
pengujian autoagregasi. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak 3 kali ulangan dan
duplo. Persentase koagregasi dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Koagregasi (%) = (Ax + Ay)/2 – A(x+y) x 100
Ax + Ay/2
Keterangan : Ax
Ay
A(x+y)
= nilai absorbansi bakteri x
= nilai absorbansi bakteri y
= nilai absorbansi kultur campuran (bakteri x dan y)
Pengujian Penempelan BAL pada Usus Tikus Secara in vitro (Modifikasi Kost et
al. 2003). Pengujian penempelan BAL pada usus tikus secara in vitro mengacu pada
Kost et al. (2003) yang dimodifikasi pada perlakuan usus dengan mukus dan usus
tanpa mukus. Sampel usus halus tikus yang sebelumnya telah mendapat perlakuan
(lihat persiapan sampel usus) dipotong-potong dengan ukuran 1cm2, kemudian dibagi
ke dalam beberapa kelompok perlakuan yaitu kontrol usus yang tidak dicuci dengan
larutan PBS (K1) dan kontrol usus tikus yang dicuci sebanyak tiga kali dengan
larutan PBS (K2). Pencucian dengan PBS dilakukan pada suhu 4 oC selama 30 menit
untuk menghilangkan mukus pada permukaan usus.
Sampel usus dari kedua kelompok perlakuan kemudian diinkubasi dengan
suspensi bakteri (109 sel dalam PBS) pada suhu 370C selama 30 menit. Suspensi
bakteri yang digunakan yaitu L. plantarum D-01, L. lactis D-01, L. acidophilus Y-01
dan B. longum Y-01. Masing-masing kelompok usus yang telah diinkubasi dibagi lagi
menjadi dua kelompok perlakuan yaitu usus yang tidak dicuci larutan PBS (P1) dan
usus yang dicuci dua kali dengan larutan PBS (P2), sehingga terdapat empat
perlakuan dalam pengujian tersebut.
Semua usus yang sudah mendapatkan perlakuan (K1P1, K1P2, K2P1 dan
K2P2) kemudian difiksasi dalam 10% formalin, dilakukan dehidrasi dengan alkohol
konsentrasi bertingkat, yaitu 70%, 80%, 90% dan 95%, selanjutnya dilakukan
embedding dan parafinasi, dipotong secara serial (5 µm) menggunakan mikrotom,
lalu dilakukan penempelan pada gelas obyek, direkatkan dengan entelan atau
27
mounting, diwarnai dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin kemudian diamati secara
mikroskopis dan hasilnya didokumentasikan. Tahapan proses pengujian penempelan
BAL pada usus tikus secara in vitro dapat dilihat pada Gambar 10.
Tikus diberi pakan broiler starter +
H0-H5
dicekok amoksisilin
Tikus hanya diberi pakan broiler starter
H6-H11
Tikus dibius, dibedah dan diambil organ usus halus
Usus halus dipotong-potong sebesar 1 cm2
K1(usus dengan mukus):
K2 (usus ≠ mukus):
usus ≠ dicuci dgn PBS
usus dicuci 3x dgn PBS suhu 40oC selama 30 menit
Usus diinkubasi dengan
9
Usus diinkubasi dengan
suspensi BAL (10 sel dalam
suspensi BAL (109sel dalam
PBS) pada suhu 37oC
PBS) pada suhu 37oC
selama 30 menit)
selama 30 menit)
K1P1:
K1P2:
K2P1:
K2P2:
Usus dengan mukus
Usus dengan mukus
Usus ≠ mukus dan
Usus ≠ mukus dan
dan ≠ dicuci PBS
dan dicuci 2x PBS
tidak dicuci PBS
dicuci 2x PBS
masing-masing sampel Fiksasi & dehidrasi
embedding dan parafinasi
sampel dipotong (5µm) dengan mikrotom
sampel direkatkan dengan entelan
pewarnaan dengan Hematoksilin & Eosin
pengamatan secara mikroskopis & dokumentasi
Gambar 10. Tahapan Proses Pengujian Penempelan BAL pada Usus Tikus in vitro
28
Pengujian Penempelan BAL pada Permukaan Padat (Dewanti dan Wong,
1995). Analisis penempelan dilakukan dengan membiarkan sel BAL untuk
menempel pada permukaan SS selama satu jam pada suhu kamar (27 + 0,5oC),
dengan konsentrasi BAL 108 CFU/ml. Pelat SS kemudian dibilas dengan air steril,
diwarnai dengan larutan acridine orange 0,026% selama 5 menit, kemudian dicuci
kembali dengan air steril. Jumlah BAL yang menempel dihitung dengan menggunakan mikroskop epifluoresen. Bakteri kemudian dibedakan secara morfologi.
Metode analisis pengujian penempelan sel bakteri pada permukaan padat
(stainless steel) diawali dengan mengukur diameter bidang pandang mikroskop (D).
Diketahui bahwa D sebesar 0,17 mm. Luas bidang pandang mikroskop dihitung
dengan rumus sebagai berikut:
Luas bidang pandang (mm2) = ¼
D2
Hasil perhitungan luas bidang pandang mikroskop yaitu 0,0227 mm 2 atau
0,000227 cm2. Penentuan jumlah bakteri yang melakukan penempelan dilakukan
dengan pertama-tama menghitung jumlah bakteri yang menempel pada sepuluh
bidang pandang, lalu jumlah tersebut dirata-ratakan. Penentuan jumlah bakteri yang
menempel dalam CFU/cm2 digunakan rumus sebagai berikut:
Jumlah bakteri yang menempel per cm2 = rata-rata jumlah koloni
0,000227
Angka yang diperoleh dinyatakan dalam bentuk logaritma. Angka yang
diperoleh menunjukkan jumlah bakteri asam laktat yang menempel pada permukaan
padat stainless steel.
Analisis Data
Data dari hasil pengujian autoagregasi dan koagregasi berupa persentase dan
ditampilkan dalam bentuk tabel. Hasil pengamatan penempelan bakteri pada sampel
usus tikus dan pada permukaan padat stainless steel ditampilkan dalam bentuk
gambar dan pengamatan dilihat secara kualitatif. Selain itu, ditampilkan data jumlah
bakteri yang menempel pada stainless steel dalam bentuk tabel dengan nilai populasi
dalam satuan CFU/cm2. Hasil dari pengujian-pengujian tersebut kemudian akan
dianalisis menggunakan analisis deskriptif.
29