Teknik molekuler (Elektroforesis dan SDS PAGE)
advertisement
Keahlian dalam teknik molekular secara umum meliputi: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Ekstraksi DNA PCR RFLP RAPD DOT BLOT Kloning PAGE dll Pengantar Elektroforesis ASEP AWALUDIN PRIHANTO FPIK UB Apakah Elektroforesis? Metode pemisahan molekul (DNA, RNA, protein) melalui medium tertentu berdasarkan ukuran dan muatan listriknya Struktur dan Penyusun Protein PROTEIN – asam amino polimer STRUCTURE of Amino Acids Asam amino mempunyai (-COOH) & amina group (-NH2 ) serta rantai samping 04_05_Hydrophobic.jpg 04_29_Disulfide bonds.jpg GEL PADA ELEKTROFORESIS • Agarose Gel (DNA dan RNA) • Polyacrylamide Gel (Protein) SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) Memisahkan protein berdasarkan ukuran Sample harus dipanaskan selama 5 menit ‘sample buffer‘ yang berisi: SDS (CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+), Glukosa atau Glycerol Ionizable tracking dye (i.e., bromophenol blue) SDS-PAGE Muatan listrik protein akan dirubah menjadi muatan negatif dengan bantuan SDS SDS digunakan untuk merubah konformasi protein Polyacrylamide liquid solid Acrylamide Gel Elektroforesis % acrylamide (w/v) Kisaran efektif Dengan BIS 1:20 pemisahan - bp 3.5 1 000 - 2 000 5.0 80 - 500 8.0 60 - 400 12.0 40 - 200 15.0 25 - 150 20.0 6 - 100 Migrasi Dye pada % Polyacrylamide Gel yang berbeda % Polyacrylamide gel Bromophenol blue Xylene cyanol (41) 5 35 130 6 26 106 8 19 76 10 12 55 12 8 28 Kisaran ukuran (Kd) 36-205 24-205 14-205 14-66* 14-45* % Acrylamide 5% 7.5% 10% 12.5% 15% SDS Gel Stacking Gel 4 % acrylamide Resolving Gel 12% acrylamide Gradien Gel 5% 25% Protein Gel Protein Standard 216 kDa 132 kDa 78 kDa 45.7 kDa 32.5 kDa Resolving gel only 18.4 kDa Protein diukur dalam kiloDalton 1 amu = 1 Dalton 1,000 unit massa atom= 1 kiloDalton (kDa) Lanes: 1Molecular Weight Markers 2Supernatant 3Pellet 4Resin 5Fraction 2 6Fraction 1 Calculating Protein Size 3 6 9 216 kDa 132 kDa 78 kDa 18 22 45.7 kDa 32.5 kDa 30 18.4 kDa 30 18.4 kDa 100 80 45.7 kDa 32.5 kDa 60 18 22 40 216 kDa 132 kDa 78 kDa 20 3 6 9 Protein size 120 Calculating Protein Size Penggunaan kurfa standar untuk penentuan berat molekul protein 10 20 30 mm from top of gel Bekerja dalam Lab Prinsip dasar pengerjaan 1. Tempatkan gel pada peralatan chamber 2. Masukkan sampel dalam well/sumuran. 3. Run gel Detail Pengerjaan Menimbang agarose. Campur agarose 50- 100 ml aquades. Panaskan agarose Pasang gel dan juga sisir nya Tuangkan gel pada chamber Masukkan DNA/Protetin kedalam setiap sumuran . Agarose Gel Elektroforesis Perlahan tambahkan buffer. Pastikan semua gel terendam dalam buffer. Sebagai alternatif bisa memasukkan sampel setelah buffer dimasukkan (jangan lupa basic dye) Sambungkan kedalam listrik dengan voltase rendah Agarose Gel Elektroforesis Pasang dalam chamber dan nyalakan saklar listriknya Agarose Gel Electrophoresis umumnya akan selesai dengan waktu satu jam. lampu UV jangan lupa untuk membuat stainingnya dari EtBr. Sebelum Sesudah FMBIO® II Fluorescence Imaging System Sumur 1, 3, 5, 7 adalah marker Sumur 2, 4, 6 and 8 adalah sample Agarose vs SDS-PAGE • Untuk asam nukleat seperti DNA dan RNA. • Memisahkan berdasarkan muatan listrik, ukuran dan bentuk • Gel dibuat dari agar yang berasal dari rumput laut • Untuk protein dengan ukuran yang berbeda SIZE. • Memisahkan berdasarkan ukuran • Gel dibuat dari bubuk Polyacrylamide Semoga bermanfaat
