PPt. sidang TA

1
TUGAS AKHIR (SB-09 1358)
Pengaruh Senyawa Antikanker dari Spons Laut Aaptos
suberitoides Terhadap Profil Protein Plasma Darah Mencit (Mus
musculus) Penderita Kanker
Proposal TA
Pembimbing :
1. Awik Puji D.N., S.Si,M.Si
2. Dr. rer.nat. Maya Shovitri, M.Si
Presented by:
Noor Nailis Sa’adah
1506 100 701
2
BAB 1: PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Indonesia negara Kepulauan
Kaya Spons laut Aaptos suberitoides
Spons memiliki Senyawa
bioaktif
Senyawa
Antikanker
Pengujian Aktivitas Senyawa
Antikanker secara In vivo
3
Pengujian Aktivitas Senyawa
Antikanker Secara In vivo
Hewan uji (induksi karsinogenik
Benzo(a)piren pada mencit)
Mencit yang
menderita kanker
+
Senyawa
Antikanker
Mengkode protein khusus
Adanya perubahan profil protein
Analisa profil protein
1.2 Perumusan Masalah
Bagaimana profil protein dengan metode elektroforesis SDS-PAGE
dari plasma darah mencit (M. musculus) penderita kanker setelah
dilakukan terapi dengan ekstrak spons laut A. suberitoides dengan
dosis 500, 1000 dan 1500 mg/kg BB.
1.3 Batasan Masalah
Analisis profil protein dilakukan secara deskriptif yang meliputi ada/
tidak kehadiran pita protein, berat molekul (BM) dan tebal tipis pita
protein. Analisis profil protein hanya dilakukan pada pita protein yang
konsisten, yaitu pita protein yang hadir pada semua ulangan (ulangan
running dan individu) dan pita protein yang memiliki ketebalan
relatif sama.
1.4 Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui profil protein dengan metode elektroforesis SDSPAGE dari plasma darah mencit (M. musculus) penderita kanker
setelah dilakukan terapi dengan ekstrak spons laut A. suberitoides
dengan dosis 500, 1000 dan 1500 mg/kg BB.
1.5 Manfaat Penelitian
Mengetahui profil protein yang muncul pada mencit (M. musculus)
penderita kanker setelah diterapi menggunakan rude extract dari
spons laut A. suberitoides sehingga dapat digunakan sebagai pengembangan untuk pengobatan penyakit kanker dengan menggunakan
kemoterapi protein.
6
BAB 3: METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Pelaksanaan penelitian pada bulan Oktober 2009 - Maret 2010
Sampel spons diambil dari perairan Pasir Putih, Situbondo
Penginduksian zat karsinogenik dan pemberian zat antikanker
kepada mencit (Mus musculus) dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi Fakultas Farmasi UNAIR Surabaya
Analisa profil protein pada mencit (Mus musculus) dilakukan di
Laboratorium Pengujian dan Pelayanan Terpadu (LPPT) unit 3
UGM Yogyakarta
7
3.2 Prosedur Kerja
Persiapan Hewan Uji
– Hewan uji yang digunakan adalah mencit (M. musculus) jantan strain B Albino
clone (BALB/c) berumur 2 bulan
– Sebelum dilakukan perlakuan mencit diaklimasi dalam kandang selama 1
minggu dan diberi pakan Par G produksi Comfeed dan air minum aquades
Induksi Karsinogenik terhadap Hewan Uji dengan Benzo(a)piren
Benzo(a)piren 0,3 gr dilarutkan dalam 0,2 ml oleum olivarum. Injeksi melalui
jaringan sub kutan dilakukan 2 hari sekali selama 10 hari (5 kali).
Pertumbuhan kanker ditunggu selama ± 2 bulan.
Uji Antikanker Ekstrak Spons A. suberitoides terhadap Hewan Uji
Dilakukan pada minggu ke-15 selama ± 2 minggu
Pengamatan Profil Protein Plasma Darah Mencit
8
Tidak diinjeksi
Benzo(a)piren
Benzo(a)piren
Sehat
Kontrol
Sakit
Sehat
kontrol
Cyclophos
phamide
500
mg/kg
BB
1000
mg/kg
BB
K1
K2
K3
K4
Uji Antikanker Spons A.
suberitoides terhadap
Hewan Uji
Induksi Karsinogenik
terhadap Hewan Uji
dengan Benzo(a)piren
1500
mg/kg
BB
K5
Diberi Ekstrak spons Aaptos
suberitoides
9
Pengamatan Profil Protein Plasma Darah Mencit
a. Preparasi Sampel
Darah mencit
Ditambah EDTA
Sentrifugasi pada 3000 rpm ± 10 menit
Supernatan
(Plasma darah)
Pelet
10
Plasma darah dipipet sebanyak 5 µL
Dilarutkan dalam 145 µL aquades (Pengenceran 30x)
Sampel ditambahkan loading buffer (Lampiran 1d) sebanyak 50 µL
Sampel dipanaskan pada suhu 95 °C selama 4 menit
Sampel siap digunakan dalam Elektroforesis
11
b. Persiapan Perangkaian Alat Elektroforesis
Perangkat elektroforesis (Biorad®, Jerman) dirangkai
± 6,0 ml larutan gel pemisah 12% (Lampiran 1.g) diisikan pada plat
dan dilapisi dengan 1 ml butanol
Didiamkan 15 menit supaya memadat
Lapisan butanol dibuang
Ditambahkan larutan gel penumpuk 3% (Lampiran 1.h) di atas gel pemisah
Sisir pembentuk sumuran dimasukkan di antara plat dan didiamkan 10
menit, setelah padat sisir diambil
Laemmli (1970) dalam Maron et al., (2008)
12
c. Denaturasi Gel Elektroforesis (SDS PAGE 12%)
Plasma darah mencit
— Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam kotak elektroforesis
— Diisi dengan buffer elektroda sampai ke permukaan kotak elektroforesis
— Sampel dimasukkan ke dalam sumuran gel dengan volume 10 µl/sumuran.
— Perangkat elektroforesis dihubungkan dengan penghantar arus listrik 120V
selama 1,5-2 jam.
— Elektroforesis dihentikan sampai warna biru menyentuh dasar gel
— Gel dilepas dan dimasukkan ke kotak pewarna biru komasi (lampiran 1.e)
— Diinkubasi selama 24 jam dengan goyangan 42 rpm
— Gel dipindah ke kotak yang berisi larutan destainer untuk membuang sisa
pewarna (lampiran 1.f) selama 30-60 menit
— Larutan destainer dibuang dan diganti dengan larutan asam asetat 10%
untuk penyimpanan gel elektroforesis
— Pita protein diamati&difoto secara langsung menggunakan kamera digital
— Analisis Hasil Perhitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan standart marker, yaitu Prestained SDS PAGE (Biorad®, Jerman)
Hasil
13
Analisis Hasil Elektroforesis
Pembuatan Kurva Standar
Nilai berat molekul protein yang dicari dihitung dengan
menggunakan kurva standar
y = ax + b
x = Jarak pita-pita dari sumuran
y = nilai log dari berat molekul pita marker yang telah diketahui
sebelumnya
Dari nilai absis dan ordinat yang telah diperoleh, maka dibuat
kurva Fitted Line Plot menggunakan program Minitab (Durrani
et al., 2008).
14
Analisa Data
• Analisa data dilakukan secara deskriptif yang meliputi
ada/tidak kehadiran pita protein, BM pita protein dan
tebal tipis pita protein.
• Analisis profil protein hanya dilakukan pada pita protein
yang konsisten, yaitu pita protein yang hadir pada semua
ulangan (ulangan running dan individu) dan pita protein
yang memiliki ketebalan relatif sama.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1Konsistensi Profil Protein Plasma Darah Mencit Berdasarkan
Metode SDS-PAGE
Hasil ulangan running dan individu
Pita protein konsisten
protein V (104 kD) dan
W (49 kDa) (Gambar 4.1)
Pita protein tidak konsisten
protein X (9 kDa)
(Gambar 4.1)
Faktor yang mempengaruhi
konsistensi pita protein plasma darah
kondisi fisiologis individu yang bersangkutan
konsumsi pakan
Peningkatan konsumsi pakan karbohidrat, lemak dan protein
yang masuk ke tubuh juga
meningkat
respon imun yang spesifik
terhadap patogen
A. Karbohidrat
Karbohidrat jika jumlahnya lebih banyak daripada
yang digunakan sebagai sumber energi
disimpan dalam bentuk glikogen
asam lemak dan gliserol
(Isdadiyanto, 2008)
Dihidrolisis Diubah menjadi triasilgliserol
Lipase
dan disimpan dalam
jaringan adiposa
Asam lemak bebas dilepaskan ke dalam plasma dan bergabung
dengan albumin plasma
Asam lemak bebas dengan kadar rendah ditemukan dalam keadaan setelah makan
yang kemudian akan naik sekitar 0,5 µeq/mL pada keadaan pasca absorpsi (Murray,
2003)
(Murray, 2003)
B. Lemak
• Lemak diangkut ke berbagai jaringan dan organ tubuh untuk digunakan serta disimpan.
• Proses pengangkutan lipid di dalam plasma Penggabungan lipid non-polar dengan lipid amfipatik dan
protein untuk membentuk lipoprotein (Murray, 2003).
C. Protein
• Peningkatan konsumsi makan meningkatkan asam amino
esensial
• Asam amino berlebih tidak disimpan dalam tubuh, tetapi
akan diuraikan dengan cepat (Murray, 2003).
Respon imun yang spesifik terhadap patogen
Infeksi suatu patogen pada tubuh mencit
Aktivasi sel B berdiferensiasi menjadi
sel plasma dan sel memori
Sel plasma membentuk
antibodi spesifik
Hewan pertama kali terserang suatu
patogen mengekspresikan IgM
Hewan yang sudah pernah terserang
patogen yang sama mengekspresikan
IgG
(Murray, 2003)
BM IgM adalah 900 kDa sedangkan
IgG 150 kDa (Murray, 2003).
Perbedaan berat molekul perbedaan profil protein
4.2 Analisis Profil Protein Plasma Setelah Perlakuan Senyawa
Karsiogen dan Antikarsinogen
•
Mencit diinjeksi senyawa benzo(a)piren selama 10 hari memperlihatkan
benjolan kanker pada leher (cerviks) (Gambar 4.2).
Profil protein plasma darah kelompok mencit normal terdiri dari
pita-pita protein dengan BM 7, 9, 11, 27, 34, 49, 56, 66, 82, 104, 121, 145
dan 162 kDa (Gambar 4.3).
Dibandingkan dengan kontrol,
kelompok 3, 4, 5 dan 6 kehilangan
satu protein dengan BM 7 kDa
Kelompok 2, 3 dan 4 muncul dua protein baru
dengan BM 41 dan 115 kDa
Kelompok 5 dan 6 hanya muncul satu
protein baru dengan BM 41 kDa (Gambar 4.3).
• Penelitian Yang and Page, (1995) protein 7 kDa
merupakan protein membran yang terekspresi secara
berlebihan pada sel kanker ovarium.
• Protein 7 kDa diduga terlibat dalam proliferasi sel
kanker ovarium sehingga resisten terhadap berbagai
jenis obat (multidrug resistant).
• Pada penelitian ini protein 7 kDa ditemukan pada
kelompok mencit sehat (Kelompok 1) dan mencit sakit
kanker fibrosarkoma (Kelompok 2) dengan ketebalan
yang hampir sama.
• Kelompok 3,4, 5 dan 6 protein 7 kDa tidak terdeteksi.
Kemungkinan-kemungkinan penyebab muncul dan hilangnya
protein 7 kDa dalam penelitian ini adalah:
1. Sel normal proliferasi sel.
Protein 7 kDa berperan
dalam proliferasi sel tersebut
2. Protein 7 kDa proliferasi sel kanker fibrosarkoma
Tidak terekspresi akibat pemberian obat cyclophosphamide
dan ekstrak spons laut A. suberitoides.
Cyclophosphamide zat pengalkil apabila bereaksi
dengan DNA menyebabkan perubahan struktur DNA fungsi DNA tersebut terganggu (Rasad, 2009) diduga
menurunkan kemampuan proliferasi sel.
Ekstrak spons A. suberitoides mengandung senyawa
aaptamin golongan alkaloid (Larghi, et al., 2008).
Senyawa alkaloid antimitosis mampu mengikat tubulin
(protein penyususn mikrotubulus) menghambat polimerasi
protein ke dalam mikrotubulus (Murniasih, 2005).
Hambatan polimerasi protein mengganggu proliferasi sel.
Theilgaard et al., (2005) protein 41 kDa (α1-acid glycoprotein)
protein fase akut sebagai respon infeksi/kerusakan sel.
Respon kerusakan sel meningkatnya jenis sintesis protein plasma
di hati protein fase akut (APPs) berfungsi untuk koagulasi,
penghambat protese dan mengatur respon imun.
Apabila injeksi benzo(a)piren menyebabkan kerusakan sel diduga bahwa protein 41 kDa yang terdeteksi dalam penelitian
ini adalah protein α1-acid glycoprotein
Kelompok mencit normal tidak terdeteksi protein 41 kDa
karena tidak diinjeksi senyawa benzo(a)piren sehingga tidak
terjadi kerusakan sel.
• Pytela et al., (1985) protein 115 kDa spesifik untuk vitronektin
dalam proses adhesi/migrasi sel.
• Menurut Bandaso (2006), sel tumor dapat menembus Extra
Cellular Matrix (ECM) dengan melekat pada ECM kemungkinan sel tumor mempunyai reseptor terhadap molekul
ECM yang berperan dalam adhesi sel.
•
Diasumsikan bahwa protein 115 kDa pada fibrosarkoma sama dengan
protein 115 kDa pada sel osteosarkoma hilangnya protein 115 kDa
pengaruh dosis ekstrak spons laut A. suberitoides.
•
Pemberian cyclophosphamide dan ekstrak spons laut A. suberitoides
500 mg/kg BB diduga belum mampu menyembuhkan kanker
•
Pemberian ekstrak spons laut A. suberitoides 1000 dan 1500 mg/kg
BB diduga lebih efektif dalam menyembuhkan sel kanker
BAB 5: Kesimpulan dan Saran
1.
Terdapat perbedaan profil protein plasma darah mencit (M.
musculus) penderita kanker yang telah diterapi dengan ekstrak
spons A. suberitoides dengan konsentrasi 500, 1000 dan 1500
mg/kg BB.
2.
Dibandingkan dengan kontrol, muncul protein baru dengan BM
41 dan 115 kDa. Protein dengan BM 7 kDa hanya muncul pada
kelompok yang tidak diterapi (kelompok 1 dan 2) dan tidak
terekspresi pada kelompok yang diterapi dengan ekstrak spons
laut A. suberitoides dan obat cyclophosphamide (kelompok 3,4,5
dan 6). Protein dengan BM 41 kDa muncul pada kelompok yang
diinjeksi benzo(a)piren (kelompok 2, 3, 4, 5 dan 6). Protein
dengan BM 115 kDa muncul pada kelompok 2,3 dan 4, sedangkan
pada kelompok lainnya (kelompok 1, 5 dan 6) tidak terekspresi.
Saran
• Ekstrak spons Aaptos suberitoides yang digunakan untuk
terapi perlu dimurnikan terlebih dahulu menjadi bentuk
senyawa murni sehingga memiliki aktivitas biologi yang
lebih tinggi.
• Selain itu, perlu dilakukan evaluasi terhadap konsentrasi
ekstrak yang diberikan.
31
Lampiran
1.C Buffer Elektroda
• Tris 2,8 gram
• Glisin 14,4 gram
• SDS 1 gram
• Aquades sampai dengan 1000
ml
1.E Pewarna Gel (Biru Komasi)
•Comassie Brillian Blue R-250
0,2gr
•Asam Asetat Glasial 10 ml
•Metanol
40 ml
•Aquades
50 ml
1.G Gel Pemisah 12% (Separating
Gel)
•Aquadest
3350 µl
•LGB 2500 µl
•30% Bis-Acrylamid 4000 µl
•10% APS(Amonium persulfat) 50 µl
•TEMED 5 µl
•SDS 10% 100 µl
1.D Loading Buffer
•DBS (larutan stok) 10,0 ml
•Bromofenol Brilian Blue 0,05 gr
•Β-mercapto etanol
500 µl
1.F Larutan destainer
•Asam Asetat Glasial 100 ml
•Metanol 400 ml
•Aquades 500 ml
1.H Gel Penumpuk 3% (Stacking
Gel)
•Aquades 3200 µl
•UGB
1250 µl
•30% Bis-Acrylamid
500 µl
•10% APS(Amonium persulfat) 25 µl
•TEMED 5 µl
•SDS 10% 50 µl
32
Proposal TA
DAFTAR PUSTAKA
• Bandoso, Randanan. 2006. Aspek Biologi Molekuler Metastasis.
http://med.unhas.ac.id/index2.php?option=com_conten&dopdf=1&id=153
Diakses pada tanggal 1 April 2010
• Coutinho, A., Chanas, B., Souza, T. Frugrulhetti, I., dan Epifanio. 2002.
Anti HSV-1 Alkaloids from a Feeding Deterrent Marine Spongse of The
Genus Aaptos. Heterocycles, vol. 57. 2002. Pp. 1265-1272
• Durrani, R. Abubakar, M. Arshed, M.J. Saleha, S. Ullah, dan Ali, Q. 2008.
Biological Characterization and Protein Profiles of Two Model
Bacteria by SDS-PAGE and Ftir. Vol 3.no 5&6, journal of Agricultural
and Biological Science
• Isdadiyanto, Sri. 2008. Lemak Abdominal Mencit (mus musculus) Setelah
Pemberian Kitin Per-oral. J. Sains & Mat. Vol. 16 No. 3 Juli 2008: 150152
•
Larghi, E., Obrist, B., and Kaufman, T. 2008. A formal total synthesis of the marine
alkaloid aaptamine. Tetrahedron Volume 64, Issue 22
•
Maron, P.A., Maitre, M., Mercier, A., Lejon, D.P.H., Nowak, V., and Ranjard, L. 2008.
Protein and DNA Fingerprinting of a Soil Bacterial Community Inoculated into Three
Different Steril Soil. Research in Microbiology 159 (2008) 231-236
•
Pytela, R., Michel D., Pierschbacher and Erkki R. 1985. A 125/115-kDa Cell Surface
Receptor Specific for Vitronectin Interacts with the Arginine-glycine-aspartic acid
Adhesion Sequence Derived from Fibronectin. Cell Biology Proc. Natl. Acad. Sci.
USA Vol 82, pp. 5766-5770, September 1985
•
Theilgaard, K., Lars C., Thomas R., Carsten U., Lene U., Rehannah B., Maged G.,
Peter D., Adrian F., Jero C., Bo T. dan Neils B. 2005. Highly glycosylated α1-acid
glycoprotein is synthesized in myelocytes, stored in secondary granules, and released
by activated neutrophils. Uncorrected Version. Published on June 7, 2005 as
DOI:10.1189/jlb. 0105042
•
Yang, Xiaowei and Michel P. 1995. An Mr 7 kDa Membrane Protein Overexpressed in
human multidrug-resistant ovarian cancer cell. Cancer Letters 88 (1995) 171-178
34
Proposal TA
TERIMA KASIH