Elektroforesis - WordPress.com

Elektroforesis
Marlia Singgih Wibowo
School of Pharmacy ITB
Pendahuluan
Suatu elektroforegram
Suatu elektroforegram
Elektroforesis
• Electro – phoresis = “being carried”
• “Electrically induced movement of
particles” : gerakan partikel yang
bermuatan di dalam suatu media yang
diberi arus listrik
• Digunakan untuk pemisahan suatu
campuran senyawa yang bermuatan :
protein atau DNA
Protein
• Proteins adalah “building blocks of life”. Secara
kimiawi, protein adalah molekul yang terbentuk
dari suatu urutan asam amino yang
dihubungkan dengan ikatan peptida .
• Susunan dari beberapa amino acids sepanjang
rantai peptida tersebut disebut struktur primer
(primary structure) protein, secara experimen
dapat dibuktikan melalui teknik sequencing atau
dengan analisis DNA yang meng-encoding
specific proteins.
Struktur Protein
Struktur primer, sekunder, tersier dan kuartener
Struktur protein
Analisis protein
Penggunaan elektroforesis
dalam analisis
• Analisis kualitatif Untuk Protein
• Analisis kualitatif DNA
Penggunaan dalam biologi melekul
• Proteomic studies : untuk menentukan gen
yang bertanggung jawab dalam
menghasilkan suatu protein dan
menentukan fungsi protein tersebut
• “proteomic” : studi tentang struktur, fungsi
dan regulasi protein suatu organisme
Prinsip dasar elektroforesis
• Elektroforesis adalah suatu proses migrasi
molekul bermuatan di dalam suatu media yang
bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya
tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk
setiap molekul yang terlibat.
• Pada saat arus listrik diberikan, molekul
bermigrasi melalui media (biasanya berupa gel),
molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat
daripada yang besar, sehingga akan terjadi
pemisahan
Elektroforesis vertikal untuk
analisis protein
Elektroforesis horizontal untuk
analisis DNA
Elektroforesis DNA
• Pada gel electrophoresis untuk DNA, enzim restriksi
memotong DNA menjadi beberapa fragmen dengan
panjang bervariasi. Larutan yang mengandung fragmen2
ini ditempatkan di dalam suatu gel tebal. Bila arus listrik
diberikan pada gel tersebut, maka satu sisi gel
akanbermuatan positif sedangkan sisi lainnya akan
bermuatan negatif.
• Semua fragmen tadi akan bergerak dari sisi gel yang
bermuatan negatif ke arah ujung yang bermuatan positif.
Fragmen yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat
dibandingkan yang berukuran lebih besar.
• Apabila arus listrik dihentikan , fragmen DNA tadi telah
terpisah-pisah di dalam gel tersebut dan yang berukuran
lebih kecil akan berada lebih dekat pada ujung postif.
Fragmen tersebut akan terlihat seperti bentuk barcode.
• setiap bar dlm pola tersebut mengandung DNA
fragments dgn ukuran tertentu . Scientists dpt
mengidentifikasi specific restriction fragments dengan
melihat posisinya pada gel.
• Urutan DNA complement dpt digunakan sbg probe
untuk menentukan restriction fragment pada gel yang
memiliki urutan nukleotida tertentu.
• Contoh : Scientists dpt menggunakan DNA darah
dilokasi kriminal untuk mengungkap pelaku kejahatan.
Jika contoh darah sesuai dengan yg terdapat pada gel
elektroforesis , maka proses pairing akan terjadi
Elektroforesis Protein
• Metode yang paling umum untuk memisahkan
protein adalah dengan cara electrophoresis
menggunakan discontinuous polyacrylamide gel
sebagai medium penyangga dan sodium
dodecyl sulfate (SDS) untuk men-denaturasi
protein.
• Metode ini disebut Sodium Dodecyl Sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE).
• Metode ini disebut juga “Laemmli method”
karena penemunya U.K. Laemmli, adalah yang
pertama kali menggunakan metode SDS-PAGE
ini
Apa gunanya SDS?
• SDS (juga disebut Lauril sulfat) adalah suatu
deterjen anionik, yang apabila dilarutkan
molekulnya memiliki muatan negatif dalam
range pH yg luas.
• Suatu rantai polipeptida dpt berikatan dgn
sejumlah tertentu SDS sesuai ukuran molekul
(Molecular mass). Muatan negatif SDS akan
menghancurkan sebagian besar struktur
kompleks protein, dan secara kuat tertarik ke
arah anoda (positively-charged electrode) bila
ditempatkan pada suatu medan elektrik.
1-D Electrophoresis
• Ketika protein dan macromolecules lain di
treatment dengan SDS suatu strong detergent,
maka mereka akan ter denaturasi dan akan
bermuatan negatif.
• Jumlah yang terikat akan proposional dengan
massa.
• Jumlah yang tertarik per unit massa di electric field
adalah sama dan seluruh molekul akan bergerak
dengan kecepatan yang sama bila tidak ada friksi.
• Pada proses electrophoresis dengan SDS
dilakukan di dalam suatu gel yang akan melewati
pori-pori gel., sehingga kemudahan pergerakan
melalui pori tergantung pada diameter molekul.
• Molekul yg lebih besar akan tertahan dan akibatnya
bergerak lebih lambat .
• Karena molekul terdenaturasi, diameter nya tergantung
dari berat molekulnya. Makin besar diameter
molekulnya, semakin lambat gerakannya.
• Dengan demikian electrophoresis + SDS akan
memisahkan molekul berdasarkan molecular weight,
tidak hanya native charge.
• Catatan : Protein dgn panjang yang sama biasanya tidak
dapat dipisahkan dengan by gel electrophoresis + SDS.
Perbedaan MW yg disebabkan oleh perbedaan R groups
tidak cukup untuk terjadinya pemisahan. Jika dua protein
bermigrasi bersamaan maka diasumsikan bahwa mereka
memiliki BM yang sama karena panjangnya kurang lebih
sama. (walaupun jenis aa berbeda tapi jumlahnya mgk
sama).
2-Dimensional Electrophoresis
• Umum digunakan : 2-D polyacrylamide gel
electrophoresis
• Memisahkan, identifikasi, dan mengukur seluruh
protein yang terdapat dalam suatu sample sel
• Pada dimensi pertama, Protein dipisahkan pada
titik isoelektriknya yaitu pada pH dimana muatan
tiap protein sama dengan 0. Pada dimensi
kedua, protein lalu didenaturasi sedemikian
sehingga setiap residu asam amino mempunyai
muatan tertentu. Selanjutnya protein dipisahkan
berdasarkan ukurannya.
Bahan penyangga
• Berupa gel (sediaan semisolid transparan)
• Utk pemisahan protein : digunakan gel
polyacrylamide
• Utk pemisahan DNA : digunakan gel
agarose
Komposisi gel untuk
pemisahan protein
• Gel dengan komposisi 7 sampai 15%
acrylamide, tergantung pada rentang
protein yang akan
• Separating gel buffer stock (4x conc)
terdiri dari 0.4% SDS, 1.5 M Tris-Cl, pH
8.8.
Denaturasi sampel protein
• Berbagai larutan dapar (buffer) digunakan dalam
SDS-PAGE , namun untuk proses denaturasi
sample dapat digunakan prinsip yg sama :
• Denaturasi : campuran protein sample 1:1
dengan 2x kons buffer yg mengandung 2%
SDS, 20% glycerol, 20 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2
mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA),
plus suatu reducing agent spt dithiothreitol
(DTT) atau 2-mercaptoethanol, dan sejumlah
kecil bromophenol blue t, dye utk tracking (0.1
mg/ml)
Proses pembuatan gel
• Acrylamide akan berpolimerasi secara spontan
bila tidak ada oxygen, jadi sangat penting
membuang oxygen dari larutan
• Polimerasi akan lebh sempurna bila larutan
dilakukan de-gassing dibawah vacuum selama
5 min
• Awali polimerisasi dengan menambahkan
freshly prepared10% ammonium persulfate (AP)
ke dalam campuran lalu diikuti dengan
menambahkan N, N, N', N'tetramethylethylenediamine (TEMED).
• Umumnya : 100 µl AP dan 10 µl TEMED per 10
ml gel mix
Hal penting yang harus diperhatikan dalam
pembuatan gel
• Acrylamide adalah senyawa toksik sehingga harus
menggunakan gloves saat bekerja dengan larutan ini.
Pekerrjaan dilakukan di ruang yg berventilasi dan Stock
solutions harus disimpan di fume hood.
• Labu erlenmeyer digunakan utk mencampur acrylamide,
lebih baik yg bertutup sehingga mudah untuk
mengeluarkan oksigen dengan cara vakum.
• Acrylamide gel stock harus di label sesuai dengan
acrylamide monomer content.
• Formulasi yg diusulkan : acrylamide stock 29.2%
acrylamide dan 0.8% bis-acrylamide, sebagai crosslinker (cross linking gives the gel its mechanical stability).
• The stock solution is labeled 30% T (29.2 + 0.8 = 30),
2.5% C bis (0.8 is 2.5% of 30).
Mempersiapkan gel
Loading ke dalam gel
• Hamilton syringes digunakan untuk
loading samples ke dalam sumuran (wells)
• Idealnya glycerol di dalam sample dapat
membantu sample menggenang (sink)
dengan baik pada dasar sumuran
• Jumlah sample yg baik kira-kira 20 µl atau
lebih.
Menjalankan gel
• Anode (+ electrode) harus dihubungkan pada
bagian dasar chamber dan Cathode pada
bagian atas chamber.
• Protein yang bermuatan negatif akan bergerak
menuju anode,Gel biasanya dialiri listrik pada
voltase kira-kira 150 Volts untuk mencegah
overheating
• Overheating dapat mendistorsi acrylamide
bahkan dpt merusak pelat.
Staining the gel
• Yang biasa digunakan utk deteksi proteins dlm
polyacrylamide gels adalah 0.1% Coomassie Blue dye in 50%
methanol, 10% glacial acetic acid.
• Acidified methanol akan mengendapkan proteins. Staining
biasanya dilakukan semalam dengan agitasi. Agitasi akan
membantu sirkulasi dye, fasilitasi penetrasi, dan membantu
uniformity staining.
• Pewarna (The dye) hanya terikat dengan protein, Excess dye
akan dikeluarkan dengan cara 'destaining' dgn acetic
acid/methanol, dan agitasi.
• Paling efficient destaining dilakukan 2 tahap :50% methanol
dan 10% acetic acid for 1-2 hours, Kedua 7% methanol, 10%
acetic methanol.
• Pada cucian pertama gel akan shrinks, squeeze out liquid
component,
• Pada cucian kedua gel akan swells and clears in the second
solution.
• Pola pita yang terbentuk akan berwarna biru dengan latar
belakang jernih.
Hasil elektroforesis
Elektroforesis DNA
DNA
marker
Produk PCR
PCR Fingerprints of Replicates of an isolate
of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of
Preservation with Mr Primer
L to R:1,18 100 bp ladder,2-6 lyophilised ,7-11 mycelial plugs in
water , 12-16 cryopreserved, 17 control
M. Ryan
Pengukuran dan perhitungan
Perhitungan dan Interpretasi
Membrane 7
1,20
y = -1,2916x + 1,2809
2
R = 0,9949
MW, log
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00
0,20
0,40
0,60
Distance, cm
0,80
1,00
1,20
Normalisasi pola elektroforesis
H37Rv Pattern
6,00
5,00
MW(kb)
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
1
2
3
4
5
6
Numbe rs of Re pe ate d Expe rime nt
7
8
Blotting
• Southern Blot : untuk identifikasi DNA
• Western Blot : untuk identifikasi Protein
• Northern Blot : untuk identifikasi RNA
Southern Blot
Prosedur Southern Blot
•
•
•
•
DNA (genomic or other source) is digested with a restriction enzyme
and separated by gel electrophoresis, usually an agarose gel.
Because there are so many different restriction fragments on the
gel, it usually appears as a smear rather than discrete bands. The
DNA is denature into single strands by incubation with NaOH.
The DNA is transfered to a membrane which is a sheet of special
blotting paper. The DNA fragementsw retain the same pattern of
separation they had on the gel.
The blot is incubated with many copies of a probe which is singlestranded DNA. This probe will form base pairs with its
complementary DNA sequence and bind to form a double-stranded
DNA molecule. The probe cannot be seen but it is either radioactive
or has an enzyme bound to it (e.g. alkaline phosphatase or
horseradish peroxidase).
The location of the probe is revealed by incubating it with a colorless
substrate that the attached enzyme converts to a colored product
that can be seen or gives off light which will expose X-ray film. If the
probe was labeled with radioactivity, it can expose X-ray film
directly.
The figure on the left shows a photograph of a 0.7% agarose gel that has 14 different samples loaded
on it (plus molecular weight marker in the far right lane and a glowing ruler used for analysis of the
results). Each sample of DNA has been digested with the same restriction enzyme (EcoRI). Notice
that the DNA does not appear as a series of discrete bands but rather as a smear. The DNA was
transferred to nitrocellulose and then probed with a radioactive fragment of DNA that was derived from
the transformed gene. The figure on the right is a copy of the X-ray film and reveals which strains
contain the target DNA and which ones do not.
Western Blot
Lyme disease reactive Western blot
Description of lanes:
Lane 1 - molecular weight marker
Lane 2 - positive patient sample
Lane 3 - positive patient sample
Lane 4 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 5 - monoclonal antibodies for 41kD
band
Lane 6 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 7 - monoclonal antibodies for 31
and 34kD bands
Lane 8 - positive control pool
Northern Blot