ACARA V ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA LANDASAN TEORI

ACARA V
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
LANDASAN TEORI
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa
digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel
DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya,
makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan
dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul
DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya
dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam
larutan etidium bromid.
TUJUAN
Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa
BAHAN DAN ALAT
1. DNA kromosom bakteri
2. DNA plasmid
3. DNA marka, misalnya DNA λ yang dipotong dengan Hind III
4. Sampel DNA lainnya, misalnya fragmen hasil PCR
5. Agarosa
6. Larutan bufer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glasial; 100 mL
EDTA 0,5M pH8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 mL)
7. Akuades
8. Gelas ukur 1000 mL
9. Labu erlenmeyer 50 mL
14
10. Mikropipet 100 μL beserta tipnya
11. Sarung tangan
12. Kertas parafilm
13. Seperangkat alat elektroforesis
14. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe
4000; EDTA 120 mM)
15. Larutan Etidium bromid (EtBr)
16. Larutan MgSO4
17. UV transiluminator
18. Kaca mata UV
CARA KERJA
1. Buat 250 mL larutan bufer TAE 1x dengan cara mencampurkan 5 mL TAE 50x ke
dalam 245 mL akuades.
2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke
dalam 20 mL bufer TAE 1x dan dididihkan hingga larut sempurna.
3. Siapkan baki elektroforesis, lekatkan selotip di tiap ujung baki elektroforesis
(Pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing
ujung baki).
4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki dengan posisi hampir menyentuh
dasar baki.
5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan;
jika suhunya sudah turun hingga sekitar 60ºC, tuangkan larutan agarosa ke dalam
baki elektrofesis, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.
6. Ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
7. Masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang
telah diisi dengan sisa larutan bufer TAE 1x (Pastikan bahwa gel terendam
seluruhnya dalam TAE).
8. Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
15
9. Masukkan 10 μL sampel DNA dan 2 μL loading dye 6x ke dalam sumuran gel
dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata
pada kertas parafilm.
10. Buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
11. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (Pastikan bahwa kabel
yang tersambungkan ke kutub negatif berada di dekat sumuran, sedang kabel yang
tersambung ke kutub positif berada jauh dari sumuran; jika tidak demikian, ubahlah
posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
12. Nyalakan sumber arus, aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka
70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.
13. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada
sumber arus.
14. Elektoforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang
ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari
tangki elektroforesis.
15. Dengan menggunakan sarung tangan masukkan gel agarosa ke dalam larutan EtBr
selama 2 menit, kemudian pindahkan ke larutan MgSO4 selama 1 menit.
16. Keluarkan gel dan letakkan di atas UV transiluminator (Letakkan selubung kaca
hitam di atas UV transiluminator).
17. Nyalakan UV transiluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.
HASIL
Gambarlah pita-pita DNA hasil elektroforesis sesuai dengan nomor sumuran dan jenis
sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan membandingkannya
dengan posisi migrasi pita-pita pada DNA marka.