Eksplorasi, Isolasi dan Kuantifikasi ß

III. Bahan dan Metode
A.
Bahan
Sampel yang digunakan adalah bakteri penghasil
biopigmen hasil isolasi dari Acropora nasuta yang diambil
dari Taka Cemara Karimunjawa, Jepara, Jawa Tengah.
Bahan kimia yang digunakan diantaranya yeast extract,
peptone, agar bacteriological, untuk isolasi dan kultur
bakteri, etanol, n-heksana, aseton, metanol, asetonitril,
ammonium asetat, gas N2, akuades, dan akuabides untuk
ekstraksi dan identifikasi pigmen dengan UV-Tampak dan
KCKT. TE buffer, lysozym, SDS 10%, NaCl 5 M, CTAB,
Chloroform, Isopropanol, Etanol 70% digunakan untuk
ekstraksi DNA. Akuabides steril, primer 27oF, primer
1492R, DNA template pengenceran 100x, Mega Mix Royal
untuk identifikasi bakteri.
B.
Metode
Sampling Organisme Laut
Sampel karang lunak Acropora nasuta diambil dari
perairan Taka Cemara Karimunjawa di kedalaman kurang
lebih 2 meter dengan peralatan scuba diving. Setelah
pengambilan, sampel karang lunak segera dimasukkan ke
dalam cool box yang sebelumnya telah diisi dengan es.
11
Sampel
dicuci
3×
dengan
akuades
steril
untuk
menghindari kontaminasi air laut.
Pembuatan Media dan Isolasi Bakteri
Media yang digunakan adalah ZoBell 2216E marine
agar medium. Sebanyak 1 L media Zobell 2216E Agar
dibuat
dengan
mencampurkan
7.5
gram
agar
bacteriological, 2.5 gram peptone, 0.5 gram yeast extract
ditambahkan air laut hingga mencapai volume 1000 mL
dan
dihomogenisasi
Campuran
tersebut
dengan
pengaduk
selanjutnya
magnetik.
disterilisasi
dalam
autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit.
Isolasi
bakteri
dilakukan
dengan
pemotongan
bagian tubuh organisme laut, kemudian diencerkan dan
ditanam pada media Zobell 2216E Agar dalam cawan
petri. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar (±30oC)
selama
48
jam
(Radjasa
dkk,
2007).
Berdasarkan
morfologi warna dari koloni-koloni bakteri yang tumbuh,
dilakukan pemurnian dengan teknik goresan (streak
method) pada cawan petri (Madigan dkk, 2000).
12
Reaksi berantai polimerase (PCR) 16S rDNA
1. Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan menurut Ausubel dkk
(1995). Kultur bakteri cair sebanyak 3 mL dimasukkan ke
dalam tabung eppendorf 1,5 mL, kemudian disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (cairan)
dibuang sehingga akan didapat sel-sel bakteri dalam
bentuk pelet. Pelet bakteri ditambahkan 500 μL TE buffer
lalu divortex selama 5 menit, ditambahkan 40 μl Lysozym
dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37°C selama
1 jam. Selanjutnya larutan ditambahkan 200 μL SDS 10%
dan diinkubasi kembali, selanjutnya larutan ditambahkan
100 μL NaCl 5 M dan 80 μL CTAB dan diinkubasi pada
suhu 68°C selama 10 menit sampai larutan jernih.
Larutan ditambahkan kloroform sampai volume tabung
1,5 mL lalu tabung dibolak-balik dan disentrifugasi pada
13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan di bagian atas
cincin
dipindahkan
ke
tabung
eppendorf
baru,
ditambahkan Isopropanol (dengan volume 0,6x volume
supernatan) kemudian dibolakbalik dan disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang,
lalu ditambahkan 100 μL Etanol 70% dan disentrifugasi
kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Etanol dibuang
(usahakan agar pelet tidak ikut terambil) kemudian pelet
13
dikering anginkan. Setelah kering, pelet ditambahkan 15
μL TE Buffer. Ekstrak DNA disimpan dalam lemari
pendingin pada suhu -20oC.
2. Amplifikasi PCR 16S rDNA
Campuran bahan-bahan yang digunakan yaitu
akuabides steril (9,5 µl), primer 27oF (1 µL), primer 1492
R (1 µL), DNA template pengenceran 100x (1 µL), Mega Mix
Royal (12,5 µL) sehingga total volume 25 µL. Primer yang
digunakan untuk PCR 16S rDNA adalah primer universal
27oF (5'-AGAGTTTGATCMTG GC TCAG-3') dan primer
spesifik
eubacteria
GYTACCTTGTTACGACTT-3')
1492R
(Isnansetyo
(5'-TACG
dan
Kamei,
2003). Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung
PCR
0,2 mL, dengan perlakuan suhu yang digunakan
pada PCR adalah: denaturasi pada 94oC selama 3 menit,
kemudian sebanyak 30 siklus (annealing pada 55oC
selama 60 detik, extension pada 72oC selama 90 detik dan
terakhir ~4oC (Sabdono, 2001).
Visualisasi produk PCR 16S rDNA ini dilakukan
melalui elektroforesis dengan memasukkan 5 μL produk
PCR ke dalam sumur gel agarosa 1%. Pembuatan gel
agarosa 1% dilakukan dengan melarutkan 1 g agarosa
dalam 100 mL larutan TAE buffer 1x, lalu dipanaskan
sampai homogen (jernih). Larutan gel dituang dalam
14
cetakan dengan sisir cetakan yang dipasang dengan posisi
tegak hingga melewati sisir sesuai dengan ketebalan yang
diinginkan.
Gel
dibiarkan
beberapa
saat
sampai
mengeras. Selanjutnya gel direndam dalam larutan buffer
TAE 1×, kemudian dielektroforesis dengan voltase sebesar
100 V selama ± 30 menit. Setelah elektroforesis, gel
direndam dalam etidium bromida selama 10 menit untuk
mewarnai pita DNA yang terperangkap pada gel. Terakhir,
pita
hasil
PCR
dapat
dilihat
dengan
alat
UV
transluminator.
3.
Purifikasi Produk PCR 16S rDNA
Purifikasi
dilakukan
untuk
mendapatkan
DNA
murni hasil amplifikasi PCR 16S rDNA. Bahan yang
digunakan yaitu High Pure PCR Product Purification Kit
(Roche, Germany) yang terdiri dari tiga larutan yaitu,
larutan 1 (binding buffer), larutan 2 (washing buffer) dan
larutan 3 (elution buffer).
Langkah
awal
dalam
proses
purifikasi
adalah
fragmen DNA target pada gel agarosa dipotong secara
utuh menggunakan cutter tajam dan steril yang kemudian
fragmen DNA tersebut ditampung dalam tabung ependorf
1,5 mL (berat tabung sudah ditera sebelumnya). Tabung
ependorf ditimbang kembali untuk mendapatkan berat gel
agarosa. Larutan 1 ditambahkan ke dalam tabung (setiap
15
100 mg gel agarosa ditambahkan 300 µL larutan 1)
kemudian divortex selama 15-30 detik. Selanjutnya DNA
diinkubasi dalam waterbath pada suhu 56oC selama 10
menit, namun setiap 3 menit sekali divortex. Setelah gel
mencair, larutan ditambahkan isopropanol 150 µL pada
setiap
100
mg
gel
agarosa.
Selanjutnya
larutan
dimasukkan dalam tabung filter yang telah dimasukkan
dalam tabung receiver sebelumnya dan disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 30 detik. Penyaringan dilakukan
sampai larutan hasil pengenceran gel agarosa habis.
Tabung filter mempunyai matriks pengikat DNA yang
akan menahan DNA target. Pelet yang tersaring dalam
tabung filter diambil, ditambahkan 500 µL larutan 2, lalu
disentrifugasi
pada
13.000
rpm
selama
1
menit.
Supernatan dibuang dan ditambahkan kembali dengan
larutan 2 sebanyak 200 µL lalu divortex selama 1 menit.
Supernatan dibuang, tabung filter dipindahkan ke dalam
tabung ependorf steril yang baru. Sebanyak 50 µL larutan
3 dimasukkan ke dalam tabung filter dan disentrifugasi
kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Hasil purifikasi
DNA (larutan yang tertampung dalam tabung) kemudian
dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% untuk
mengetahui hasil purifikasi.
16
Sekuensing
Sekuensing
dilakukan
sekuensing menggunakan
menurut
Big
siklus
PCR
Dye Terminator v.3.1.
Formula untuk reaksi PCR sekuensing yaitu: 2 μL big
dye, 2 μL buffer 10x, 4 μL templet DNA, 1 μL primer
dengan konsentrasi 3,2 pmol, ddH2O hingga volume akhir
10 μL.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan pengkodisian
alat (96°C selama 2 menit), selanjutnya sebanyak 25
siklus dengan
ketentuan denaturasi (96°C selama 10
detik); annealing (50°C selama 5 detik); dan extension
(60°C selama 4 menit). Hasil PCR dipurifikasi dan
disekuen
menggunakan
primer
5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'
5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'.
27F
dan
1492R
Sekuen
dianalisis
secara otomatis (ABI 3130XL, Applied Biosystem).
Analisa Data BLAST Homologi
Analisis
sekuen
DNA
isolat
bakteri
terbaik
dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (data
base) DNA. Penelusuran dilakukan menggunakan internet
melalui
program
pelacakan
data
base
Basic
Local
Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for
17
Biotechnology Information, National Institute for Health,
USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul dkk, 1997).
Analisa Filogenetik
Analisis
filogenetik
bakteri
dilakukan
dengan
membandingkan sekuen bakteri terdekat dengan sekuen
16S rDNA bakteri target pada data base Gen Bank.
Analisis
BLAST
dilakukan
menggunakan
bakteri
pembanding sebagai out group. Sekuen diolah dengan
program
ClustalX.
Program
ClustalX
diaktifkan
dan
ditentukan model Multiple Alignment Mode, kemudian
ditekan File dan Load Sequences lalu dipilih data sekuen
yang ada. Langkah selanjutnya ditekan Alignment dan
dipilih Do Complete Alignment, kemudian ditekan tombol
Align sehingga keluar ALN dan DND file. Tekan Trees dan
ceck list exsclude Positions with Gaps kemudian dipilih
Bootstrap N-J Tree dan tekan OK, sehingga keluar PHB
file. Terakhir, dibuka program njplot dan pilih Full Tree
pada bagian Operation dan Bootstrap values pada bagian
Display. Buka file lalu Open dan pilih PHB file yang telah
dibuat tadi. Setelah itu akan keluar pohon filogenik,
langkah terakhir edit dan copy, lalu paste di program
Microsoft Word (Isnansetyo dan Kamei, 2003).
18
Seleksi
β-karoten
dengan
Ekstraksi
dan
Spektroskopi UV-Tampak
Sampel dalam kultur agar dikerok secara hati-hati
kemudian dilarutkan kedalam aquades steril dan di
presipitasi menggunakan refrigerated sentrifuge (4°C,
10.000 rpm, 10 menit). Pelet yang diperoleh kemudian
ditimbang sebanyak 0.4210 g dan kadar air diukur
menggunakan moisture balance (Shimadzu Kyoto) (kadar
air 47,0%). Sampel yang sudah ditimbang kemudian
dimasukan
ke
dalam
conical
bottom
tube
dan
ditambahkan 10 ml aseton 100%. Ekstraksi dilakukan
menggunakan vortex (IKA Vortex) skala
6 selama 4
menit. Ekstraksi dilakukan dalam kondisi inert dalam
atmosfer gas N2 (UHP grade) dan pencahayaan merah.
Ekstraksi diulang sebanyak dua kali hingga pelet tidak
berwarna. Ekstrak pigmen kemudian disaring dengan
nylon filter (Whatman, 0.2 µm) kemudian dikeringkan
menggunakan gas N2.
Kemudian
seleksi
bakteri
dilanjutkan
dengan
mengamati spektrum ekstrak kasarnya yang dilarutkan
dalam aseton menggunakan spektrofotometer ultraviolettampak berkas rangkap Varian Cary 50 pada panjang
gelombang 300–800 nm.
19
Karakterisasi β-karoten dengan KCKT
Untuk
analisa
karakterisasi
pigmen,
ekstrak
pigmen kering kemudian dilarutkan kembali dalam 0.5
mL aseton dan siap untuk diinjeksi dalam analisa KCKT.
Metode KCKT yang digunakan mengacu pada metode
Hegazi dkk. (1998). Data KCKT dan spektra serapan dari
pengukuran β-karoten digambarkan dengan Program
Origin Pro 8.1.
Identifikasi β-karoten dengan UV-Tampak
Isolasi β-karoten dilakukan dengan menampung
pigmen murni saat puncaknya muncul di kromatogram
analisa KCKT pada menit-menit terakhir (60,24 menit).
Pigmen murni kemudian dikeringkan dengan gas N 2 dan
dilarutkan ke dalam pelarut
aseton, etanol, dan n-
heksana dan diukur menggunakan spektrofotometer 1700
pada panjang gelombang 300-500 nm (Shimadzu, Kyoto).
Kuantifikasi Kandungan β-karoten
Metode
menggunakan
kuantifikasi
metode
analisa
dilakukan
dengan
multi-kromatogram
(Indrawati dkk., 2013) parameter luas puncak yang
20
dideteksi pada panjang gelombang 450 nm hingga 600 nm
dengan rentang selisih 1 nm.
Nilai rata-rata luas puncak kemudian di masukan
dalam persamaan garis :
Y = 0,0108X + 12.677 (Limantara dkk., 2013)
Dimana :
X = Luas puncak serapan
Y = Konsentrasi (mikrogram/ml)
21