15 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu

MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian
Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
penelitian ini dilakukan pada bulan Juni - Agustus 2012
Materi
Sampel Darah
Sampel darah sapi yang digunakan yaitu sapi asli dan sapi lokal sebanyak 18
sampel dari lima bangsa sapi yang yaitu sapi Bali, Madura, Pesisir, Aceh, dan PO.
Jumlah masing-masing sampel yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada
Tabel 1.
Tabel 1. Jumah Sampel Darah Ternak Sapi Indonesia
Ternak
Sapi Bali
n
Asal
2
BIB Sapi Bali, Bali
4
BPTU Sapi Bali, Bali
2
Sapudi
2
Kab. Sampang
Sapi Aceh
2
Kab. Aceh Besar
Sapi Pesisir
2
Kab. Pesisir Selatan
Sapi PO
2
Kab. Kebumen
2
Kandang A Fakultas Peternakan IPB
Sapi Madura
Total
18
Keterangan : n = jumlah individu sampel
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan pada pengambilan sampel darah adalah alkohol 70%,
es, dan kapas. Alat yang digunakan antara lain jarum venojact, tabung vacutainer 10
ml, dan termos. Sampel darah yang digunakan merupakan koleksi dari laboratorium
Pemuliaan dan Genetika Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak,
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan.
15
Amplifikasi daerah D-loop dilakukan melalui Polymerase Chain Reaction
(PCR). Bahan-bahan yang digunakan pada proses amplifikasi DNA adalah adalah
DW, sampel DNA, 10 × buffer, MgCl2, primer forward dan reverse, enzim taq,dan
dNTPs. Alat yang digunakan adalah satu set pipet mikro, alat sentrifugasi, tabung
PCR, mesin PCR, vortex, dan freezer.
Bahan yang digunakan untuk elektroforesis terdiri atas gel elektroforesis,
loading dye, dan marker 100 pb. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat gel
elektroforesis yaitu agarose, 0,5 × TBE, Ethidium Bromide.
Bahan-bahan yang
digunakan untuk membuat larutan loading dye yaitu bromothymol blue, xylene
cyanol, gliserol. Sementara, alat yang digunakan antara lain microwave, stearer,
magnet stearer, gelas ukur, tabung erlenmeyer, gel tray, pencetak untuk sumur
(comb), power supply 100 volt, gelas ukur, pipet makro dan mikro, serta UVTransiluminator. Buffer elektroda yang digunakan terdiri dari Tris, Glycine dan
aquadestilata.
Primer DNA Mitokondria Daerah D-loop
Primer merupakan molekul oligonukleotida yang berukuran pendek (sekitar
18-24 pasang basa) yang akan menempel pada DNA cetakan di tempat spesifik.
Pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi mtDNA daerah D-loop sapi
dengan runutan primer forward5′-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3′ dan primer
reverse5′-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3′ (Hassan et al., 2009).
Prosedur
Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan sampel darah sapi sebanyak sekitar 3 ml melalui vena jugularis
dengan menggunakan venojact lalu segera dimasukkan ke dalam tabung vaccutainer
yang dimasukkan kedalam termos es dan disimpan dalam suhu 4 ºC.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dari sampel darah dengan menggunakan Genomic
DNA mini kit Geneaid (Lampiran 2) yang dimodifikasi untuk penggunaan sampel
yang disimpan dalam alkohol.
16
Amplifikasi DNA Mitokondria Daerah D-loop
Amplifikasi lengkap fragmen D-loop DNA mitokondria menggunakan primer
seperti yang digunakan Hassan et al. (2009), yaitu primer Forward 5′TAGTGCTAATACCAACGGCC-3′
dan
primer
Reverse
5′-
AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3′ dengan panjang produk PCR 1145 bp (Gambar
10). Sekuen D-loop mtDNA diperoleh dari NBCI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Nomor akses standardnya adalah Bos indicus dengan kode akses AY126697.
5’−TAGTACTAATACCAACAGCCGGCACAGTTGAAAACAAATTACTAAAATGAAGACAGGTCTTTGTAGTACATCTAA
TATACTGGTCTTGTAAACCAGAGAAGGAGAACAACTAACCTCCCTAAGACTCAAGGAAGAAACTGTAGTCTCACCGTC
AACCCCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTATTCCCTGAACACTATTAATATAGTTCCATAAATGCAAAGAGCCTTAT
CAGTATTAAATTTATCAAAAATCCCAATAACTCAACACAGAATTTGCACCCTAACCAAATATTACAAACACCACTAGC
TAACATAACACGCCCATACACAGACCACAGAATGAATTACCCAGGCAAGAGGTAATGTACATAACATTAATGTAATAA
AGACATGATATGTATATAGTACATTAAATTATATACCCCATGCATATAAGCAAGTACATGATCTCTATAATAGTACAT
AATACATACAATTATTAATTGTACATAGTACATTATATCAAATCCATCCTCAACAACATATCTACTATATACCCCTTC
CACTAGATCACGAGCTTAATTACCATGCCGCGTGAAACCAGCAACCCGCTAAGCAGAGGATCCCTCTTCTCGCTCCGG
GCCCATAGACCGTGGGGGTCGCTATTTAATGAATTTTACCAGGCATCTGGTTCTTTCTTCAGGGCCATCTCATCTAAA
GTGGTCCATTCTTTCCTCTTAAATAAGACATCTCGATGGACTAATGACTAATCAGCCCATGCTCACACATAACTGTGC
TGTCATACATTTGGTATTTTTTTATTTTGGGGGATGCTTGGACTCAGCTATGGCCGTCAAAGGCCCCGACCCGGAGCA
TCTATTGTAGCTGGACTTAACTGCATCTTGAGCACCAGCATAATGATAGGCATGGGCATTACAGTCAATGGTCACAGG
ACATAAATACATTATATATCCCCCCCTTCATAAAAACCTCCCCCTTAAATATTCACCACCACTTTTAACAGACTTTTC
CCTAGATACTTATTTAAATTTTCCACACTTTCAATACTCAATTTAGCACTCCAAACAAAGTCAATATATAAACGCAGG
CCCCCCCCCCCCCCGTTGATGTAGCTTAACCCAAAGCAAGGCACTGAAAATGCCT-3’
Keterangan :
: Primer forward
: Primer reverse
Warna hijau menunjukkan basa nukleotida yang berbeda
Gambar 10. Situs Penempelan Primer Sekuen D-Loop DNA Mitokondria Sapi
Volume setiap reaksi PCR sebanyak 25 µl yang terdiri atas 2 µl sampel
DNA; 0,3 µl primer forward dan reverse; 0,2 µl dNTPs; 1 µl MgCl2; 2,5 µl 10 ×
buffer0,1 µl enzim Taq Polymerase; dan 18,9 µl destilation water (DW) yang
dilakukan dengan menggunakan mesin PCR model Applied Biosystems. Kondisi
PCR yang digunakan adalah: predenaturasi pada suhu 95 °C selama lima menit,
dilanjutkan dengan siklus utama yaitu tahap denaturasi pada suhu 95 °C selama 30
detik, tahap penempelan primer (annealing) pada suhu 60 °C selama 45 detik, dan
tahap polimerasi (extension) pada suhu 72 °C selama satu menit diulang sebanyak 35
siklus. Reaksi PCR diakhiri dengan polimerasi (final exstension) pada suhu 72 °C
selama lima menit.
17
Elektroforesis
Elektroforesis menggunakan agarose 1,5% dilakukan dengan cara 0,45 g
agarose dilarutkan dalam larutan 0,5 x TBE sebanyak 30 ml lalu dipanaskan dalam
microwave selama sekitar lima menit kemudian dilakukan stirer dan ditambahkan
2,5 µl EtBr. Larutan dituang ke dalam cetakan gel, diberi sisiran pada tepi gel dan
gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk
sumur-sumur.
Produk PCR sebanyak lima µl dicampurkan dengan loading dye sebanyak
satu µl dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan dalam sumur-sumur gel
dan satu sumur gel dimasukkan marker sebanyak 2 µl yang digunakan sebagai
penanda. Kemudian gel ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah
berisi larutan buffer dan dialiri listrik 100 volt selama 30 menit, molekul DNA yang
bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak (bermigrasi) ke arah positif. Gel
agarose yang telah selesai dilakukan elektoforesis kemudian diambil untuk melihat
panjang pita DNA dengan menggunakan sinar ultraviolet dalam trans illuminator.
Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-masing
pita sampel DNA dengan posisi pita DNA marker.
Perunutan Produk PCR (Sekuensing)
Pebacaan sekuen menjadi alat penting dan utama dalam biologi molekular
karena dapat mengetahui komposisi nukleotida dan asam amino suatu gen, juga
digunakan untuk menganalisis kekerabatan dan jalur evolusi (Albert et al., 1994).
Produk PCR daerah D-loop dari penelitian ini berupa pita tunggal yang berukuran
1145 pb. Analisis perunutan dilakukan di Macrogen, Korea Selatan.
Rancangan dan Analisis Data
Jarak Genetik dan Pohon Filogeni
Sekuen DNA dilakukan manual editing dengan menggunakan BioEdit.
Runutan nukleotida yang telah diedit disejajarkan dengan runutan baku nukleotida B.
indicus dari Genbank (kode akses AY126697; Mirreti et al., 2002).
Proses
pensejajaran (alignment) dilakukan dengan menggunakan program Clustal W yang
terdapat pada program MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis 5.0;
18
Tamura et a., 2007). Perhitungan komposisi basa nukleotida, jarak genetik dan
konstruksi pohon filogeni dilakukan dengan menggunakan program MEGA 5.0.
Jarak genetik digunakan untuk melihat kedekatan hubungan genetik antara sampel
yang dianalisis. Nilai jarak genetik diperoleh dengan membagi jumlah nukleotida
yang berbeda degan jumlah total nukleotida.
Perhitungan pairwise distance
digunakan untuk melihat jarak rata-rata p-distance dari basa nukleotida daerah Dloop.
Pohon filogeni direkrontruksi dengan menggunakan metode bootsraped
Neighboor-Joining (NJ) dengan 1000 kali pengulangan (Nei dan Kumar, 2000).
19