MARKER - IPB Repository

9
agarosa, dan agropektin (Bintang 2010).
Konsentrasi agarosa yang sering dipakai
berkisar antara 0.8-1.5%. Konsentrasi gel
yang sangat encer (0.1-0.2%) dapat
meningkatkan daya pisah elektroforesis tetapi
hal tersebut sulit dilakukan karena gel yang
encer sangat mudah pecah.
Larutan bufer yang digunakan dalam
elektroforesis sama dengan yang digunakan
untuk membuat gel. Bufer tersebut dapat
dibuat seperti tris-asetat-EDTA (TAE) atau
tris-borat-EDTA
(TBE).
Gel
agarosa
dicampur dengan etidium bromida (EtBr).
Penambahan
etidium
bromida
(EtBr)
bertujuan agar hasil elektroforesis dapat
teramati secara visual. Etidium bromida akan
menyisip ke dalam DNA sehingga apabila
dilihat di bawah sinar UV pita-pita DNA
menjadi terlihat karena etidium bromida akan
memendarkan sinar UV. Sampel DNA
memerlukan
loading
buffer
sebelum
dimasukkan ke dalam sumur, loading buffer
ini
berfungsi
sebagai
pewarna
dan
meningkatkan densitas sampel sehingga
fragmen tersebut berada di dasar sumur dan
tidak menyebar. Marka atau penanda yang
digunakan pada elektroforesis merupakan
campuran molekul dengan ukuran berbedabeda yang digunakan untuk menentukan
ukuran molekul dalam pita sampel (Clark &
Christopher 2008).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan meliputi mortar,
tabung sentrifus, sentrifus Beckman Coulter
AllegraTM 64R Centrifuge, tabung mikro,
neraca analitik Scaltec, pipet mikro, pipet
volumetrik,
bulp,
penangas
air,
spektrofotometer UV-VIS Beckman Coulter
DU 530, cetakan gel, sisir, labu Erlenmeyer,
sudip, gelas piala, gelas ukur, microwave,
parafilm,
power
supply,
perangkat
elektroforesis Toylab, UV Transilluminator
2201 Sigma dan kamera Power Shot A640
Canon, mesin PCR (PCR Biometra), dan
mesin DNA speed vac (Savant DNA Speed
Vac 110).
Bahan-bahan yang digunakan meliputi 58
sampel tanaman kelapa sawit yang belum
diketahui identitasnya dalam suatu populasi,
N2 (liquid nitrogen) cair, polivinil pirrolidon
(PVP) 1.5%, β-merkaptoetanol, Na-asetat 3 M
pH 5.8, etanol absolut, etanol 70%,
kloroform:isoamilalkohol (ChI:IAA) 24:1,
bufer ekstraksi yang merupakan campuran
dari CTAB 2%, EDTA 20 mM pH 8.0, trisHCl 100 mM pH 8.0, NaCl 1.26 M,
isopropanol, agarosa (Fermentas), bufer Tris
Boric EDTA (TBE) 0.5x, Etidium bromida
(EtBr) 1% (w/v), loading buffer (bromfenol
biru 2.5%:sukrosa 40%), marker 1 kb plus
DNA ladder (Invitrogen), complete buffer,
dNTPs, dan Taq DNA polimerase yang
merupakan komersial kit dari Fermentas,
primer mTcCIR (15, 26, 37, 229) dengan
urutan sekuen terlampir (Lampiran 3) serta
molecular water (MW).
Metode
Isolasi DNA (Castillo 1994)
Sampel ditimbang sebanyak 1 gram dan
ditambahkan 1 L N2 cair serta PVP 1.5%
kemudian digerus hingga halus dengan
menggunakan mortar. Selanjutnya disiapkan
bufer ektraksi masing-masing 5 ml dalam
tabung sentrifus dan ditambahkan βmerkaptoetanol, setelah itu dipanaskan pada
suhu 65°C selama 15 menit. Sampel yang
telah digerus halus ditambahkan bufer
ekstraksi dan β-merkaptoetanol dalam
keadaan hangat dan dikocok kuat hingga
homogen. Selanjutnya suspensi diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 65°C, dan setiap
10 menit dibolak-balik perlahan-lahan.
Setelah 30 menit, suspensi didiamkan selama
5 menit pada suhu ruang. Kemudian diekstrak
dengan
kloroform:isoamilalkohol
(24:1)
sebanyak 1 volume dan dikocok perlahan.
Setelah terbentuk emulsi disentrifugasi
dengan kecepatan 11000 rpm pada suhu 25°C
selama 10 menit.
Supernatan bagian atas hasil sentrifugasi
dihitung volumenya dan dipindahkan ke
tabung sentrifus baru dengan menggunakan
pipet mikro. Kemudian diekstrak dengan
kloroform:isoamilalkohol (24:1) sebanyak 1
volume sesuai volume supernatan. Setelah itu
disentrifugasi dengan kecepatan 11000 rpm
pada suhu 25°C selama 10 menit. Setelah 10
menit sentrifugasi supernatan bagian atas
dihitung volumenya dan dipindahkan ke
tabung sentrifus baru dan diekstrak dengan
isopropanol sebanyak 1 volume sesuai volume
supernatan,
dibolak-balik
perlahan.
Selanjutnya disimpan pada suhu 4°C selama
30 menit. Kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 11000 rpm pada suhu 25°C selama
10 menit. Setelah 10 menit supernatan
dibuang, dan pelet dikering anginkan selama
10 menit dengan cara meletakkan tabung
10
dengan posisi terbalik dengan dialasi tisu
dibawahnya. Pengeringan dilakukan dengan
hati-hati agar pelet tidak terjatuh dari tabung.
Pelet kemudian ditambah 500 µL bufer TE
kemudian dikocok perlahan, selanjutnya
ditambahkan natrium asetat 3 M pH 5.2
sebanyak 1/10 volume dan ethanol absolut 2
volum kemudian dibolak-balik perlahan. DNA
disimpan di dalam freezer (-20°C) selama satu
malam. DNA yang diperoleh hari sebelumnya
disentrifus dengan kecepatan 12000 rpm, 4°C
selama 10 menit. Pelet hasil sentrifus
ditambah dengan etanol 70%, kemudian
disentrifus kembali dengan kecepatan 12000
rpm, 4°C selama 2 menit. Setelah 2 menit
pelet dikeringanginkan dengan speed vacuum.
Pelet ditambah 30 µL bufer TE. DNA yang
diperoleh
kemudian
dianalisis
secara
kuantitatif
dengan
menggunakan
spektrofotometer. Analisis DNA secara
kualitatif dilakukan dengan elektroforesis gel
agarose 1%.
Pemurnian DNA
Hasil isolasi diuji kemurniannya melalui
elektroforesis gel agarosa 1% dengan aliran
tegangan listrik sebesar 75 V. Adanya
kontaminan yang tampak dari pita hasil
elektroforesis
kemudian
dimurnikan.
Pemurnian
dilakukan
dengan
cara
ditambahkan RNase 2 µg/mL. Selanjutnya
dilakukan inkubasi di waterbath bersuhu 370C
selama 60 menit.
Uji Kualitatif DNA
Uji kualitatif DNA dilakukan untuk
melihat visualisasi DNA yang berhasil
diisolasi sehingga dapat diketahui kualitasnya.
Uji ini dilakukan dengan menggunakan
elektroforesis
gel
agarosa.
Sebelum
melakukan elektroforesis disiapkan gel
agarose 1% 60 ml. Sebanyak 0.6 gram
dilarutkan dengan 60 mL TBE 0.5x.
Selanjutnya campuran dipanaskan dalam
microwave selama kurang lebih 2-3 menit
hingga larut. Setelah larut dengan sempurna,
larutan dibiarkan sampai hangat, kemudian
ditambahkan 3 μL ETBr. Larutan diaduk
perlahan lahan hingga homogen dan
dituangkan ke dalam cetakan yang dilengkapi
dengan sisir. Gel yang sudah beku kemudian
dimasukkan dalam alat elektroforesis dan
direndam dengan bufer TBE 0.5x. Proses
elektroforesis gel agarose diawali dengan
disiapkan seperangkat bak elektroforesis yang
telah berisi larutan TBE 0.5x. Selanjutnya gel
agarosa yang telah memadat dimasukkan ke
dalam bak hingga gel terendam penuh.
Selanjutnya sampel yang akan dielektroforesis
dicampur dengan loading buffer dengan
perbandingan 1:5 pada parafilm. Setelah
diresuspensi maka diinjeksi ke dalam sumur
gel agarosa. Marker yang digunakan adalah 1
kb plus DNA ladder sebanyak 0.8 µL. Setelah
semua sampel selesai diinjeksi maka alat
elektroforesis dihubungkan pada power supply
dan voltase diatur pada 75 volt. Proses
elektroforesis dilakukan selama kurang lebih
60 menit. Setelah elektroforesis selesai, gel
dikeluarkan dari alat elektroforesis kemudian
dilihat dengan bantuan sinar ultra violet (UV)
dalam trasnsilluminator.
Uji Kuantitatif DNA
Uji kuantitatif dilakukan dengan cara
mengukur absorbansi sampel DNA dengan
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang tertentu. Sebanyak 2 μl
suspensi DNA murni diencerkan hingga 200
μl dengan menggunakan MW. Selanjutnya
diukur nilai absorbansnya pada tiga panjang
gelombang yaitu 230 nm, 260 nm, 280 nm.
Serapan maksimum radiasi UV oleh DNA
berada pada panjang gelombang 260 nm.
Panjang gelombang 280 nm digunakan untuk
mengetahui adanya kontaminasi protein
sedangkan pada panjang gelombang 230 nm
untuk mengetahui kontaminasi polisakarida.
Konsentrasi DNA dihitung dengan
perbandingan bahwa pada panjang gelombang
260 nm, 1 unit absorban sebanding dengan 50
μg/ml DNA (Brown 2003). Sehingga
konsentrasi DNA bisa didapat melalui
perkalian nilai absorban dengan faktor
pengenceran dan 50 μg/ml. Kemurnian DNA
ditentukan dengan indeks kemurnian. DNA
dikatakan murni bila memiliki indeks
kemurnian antara 1.6-1.8. Kemurnian tersebut
dihitung berdasarkan kemurnian terhadap
protein (A260/A280) dan polisakarida
(A260/A230).
Optimasi Suhu Annealing Amplifikasi DNA
dengan Primer Mikrosatelit
Sebelum melakukan amplifikasi DNA
dengan menggunakan primer mikrosatelit,
terlebih dahulu dilakukan optimasi suhu
annealing agar diperoleh suhu annealing yang
tepat untuk penempelan primer pada saat
proses amplifikasi di mesin PCR sehingga
didapat amplikon sesuai dengan yang
diharapkan. Prosedur dalam melakukan
optimasi hampir sama dengan proses
amplifikasi DNA hanya saja dilakukan dengan
menggunakan PCR gradien. PCR gradien
dapat digunakan untuk melihat suhu