PENGKLONAN KANDIDAT GEN RESISTEN

7
spektrometri massa, PCR (Polymerase Chain
Reaction), pengklonan, sekuensing DNA, atau
immuno-blotting yang merupakan metodemetode
karakterisasi
lebih
lanjut
(Wilson&Walker 2000).
Prinsip teknik elektroforesis gel agarosa
adalah molekul DNA yang bermuatan negatif
di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif
(anode). Makin besar ukuran molekulnya,
makin rendah laju migrasinya. Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat diperkirakan
dengan membandingkan laju migrasinya
dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul
DNA standar (DNA marker) yang telah
diketahui ukurannya (Wilson&Walker 2000).
Pemisahan DNA atau RNA dilakukan
dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa. Agarosa berasal dari ekstrak rumput
laut yang dimurnikan berupa polimer linier
yang mengandung residu D- dan L- galaktosa
yang digabung dengan ikatan α (1→ 3) dan β
(1→ 4) glikosidik. Residu L-galaktosa
mempunyai jembatan anhidro antara posisi
ketiga dan keenam. Rantai agarosa
membentuk serat-serat helik yang bergabung
menjadi struktur superkoil dengan jari-jari 2030 nm (Sambrook et al. 1989). Konsentrasi
gel agarosa yang digunakan dalam
elektroforesis bervariasi antara 0.7%-1.5%.
Konsentrasi gel 0.8%-1% sangat baik untuk
memisahkan fragmen DNA atau RNA.
Konsentrasi gel kurang dari 0.5% dapat
meningkatkan daya pisah elektroforesis
namun sangat rapuh dan sulit ditangani.
Contoh sampel yang terdapat pada Gambar 1.
Ethidium bromida dapat ditambahkan ke
dalam suspensi DNA atau RNA untuk tujuan
visualisasi hasil elektroforesis (Sambrook et
al. 1989). Ethidium Bromida (EtBr) adalah
molekul planar siklik yang berikatan antara
pasangan basa RNA yang tertumpuk. EtBr
mengikat RNA dengan sedikit atau tidak pada
sekuens pilihan. Pada kejenuhan larutan
berkekuatan ionik tinggi, kira-kira satu
molekul ethidium disisipkan per 2.5 bp.
Setelah penyisipan ke dalam heliks, pewarna
terletak tegak lurus ke sumbu helikal dan
membuat kontak van der waals dengan
pasangan basa di atas dan di bawah
(Sambrook et al. 1989). Ethidium bromida
dapat digunakan untuk mendeteksi asam
nukleat baik yang berikatan tunggal maupun
ganda.
Bufer yang dapat digunakan untuk
elektroforesis adalah bufer Tris-Asetat EDTA
(TAE). Jenis bufer lainnya yang dapat
digunakan yaitu; TBE (Tris-Borat EDTA)
dan TPE (Tris-Fosfat EDTA). Bufer
elektroforesis biasanya dibuat sebagai larutan
berkonsentrasi dan disimpan pada suhu ruang.
Tris-Acetate EDTA (TAE) memiliki kapasitas
bufer paling rendah dari bufer elektroforesis
lainnya dan akan menjadi habis jika
elektroforesis dilakukan untuk periode waktu
yang diperpanjang(Sambrook et al. 1989).
Sampel sebelum dimasukkan ke dalam
sumur gel dihomogenisasi dengan gel-loading
buffer. Gel-loading buffer dicampur dengan
sampel sebelum dimasukkan ke dalam sumur
gel. Bufer ini memiliki tiga tujuan yaitu;
untuk meningkatkan densitas sampel supaya
memastikan bahwa RNA tenggelam ke dalam
sumur gel, menambahkan warna pada sampel
dengan demikian menyederhanakan proses
pemasukkan, dan menahan pencelup (EtBr)
dalam medan listrik sehingga bergerak ke arah
anoda pada tingkat yang telah ditentukan
(Sambrook et al. 1989).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah bakteri termofilik
Geobacillus sp20k dari sumber air panas di
Pegunungan Kerinci, vektor plasmid, enzim
ligase, enzim lisozim, enzim restriksi, bufer
restriksi, etanol absolut, etanol 75%, gel
agarosa, bufer TAE 1X, EtBr, media
heterotrof cair, es, kalsium klorida dan
akuades.
Alat-alat yang digunakan antara lain High
Pure PCR Template Preparation Kit, alat-alat
gelas, sudip, spatula, jarum ose, mikropipet,
tip, autoklaf, inkubator, oven, neraca analitik,
sentrifus Eppendorf 5415C dengan jari-jari
rotor 4 cm, tabung Eppendorf, dan vorteks.
Metode
Produksi
dan
Peremajaan
Bakteri
Termofilik
Pembuatan Media Tumbuh. Media
heterotrof padat dibuat dengan komposisi
3.18 gram bacto peptone, 0.78 gram triptone,
1 gram NaCl, 0.5 gram K2HPO4, 3 gram agar,
dan 0.02 gram selenium oksida. Campuran itu
kemudian dimasukkan ke dalam labu
Erlenmeyer, ditambah akuades hingga tepat
200 mL kemudian diaduk dan dipanaskan
sampai semua bahan larut. Larutan
disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 15
atm dan suhu 121ºC selama 15 menit. Saat
8
larutan masih hangat, dituangkan ke cawan
Petri yang telah steril. Proses penuangan
tersebut dilakukan di ruang laminar. Setelah
larutan memadat, media tersebut siap
digunakan.
Penumbuhan Bakteri. Pertama-tama
isolat bakteri termofilik ditumbuhkan ke
dalam media heterotrof padat lalu diinkubasi
pada suhu 60 ºC selama 1 hari. Isolat yang
tumbuh akan digunakan sesuai kebutuhan.
Selanjutnya, dilakukan penyuburan isolat
bakteri dengan memindahkan dua ose biakan
dari biakan peremajaan ke media heterotrof
cair dan diinkubasi selama 5 hari pada suhu
60 ºC.
Pemanenan Bakteri. Setelah sel bakteri
dalam medium cair tumbuh maka kultur sel
bakteri termofilik diperoleh dengan metode
sentrifugasi 8000 g selama 10 menit. Pelet
dan supernatan yang didapat dipisahkan.
Supernatan lalu dibuang, pelet diambil.
Isolasi DNA Kromosom Geobacillus sp
Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan
High Pure PCR Template Preparation Kit
dari Roche secara in vitro (Lampiran 2).
Pengamatan DNA dilakukan menggunakan
elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi
gel 1%.
Pemotongan DNA Kromosom dan DNA
Plasmid.
Enzim restriksi yang dipergunakan adalah
enzim EcoRI untuk memotong DNA plasmid
dan DNA asing (Lampiran 3). Pemotongan
DNA dengan enzim restriksi dilakukan
dengan cara mencampurkan 7 µL DNA
dengan 2 µL enzim restriksi, 2 µL buffer
restriksi lalu ditambahkan akuades steril
hingga 20 µL . Setelah DNA dicampur dengan
enzim dalam larutan buffer,lalu campuran
diinkubasi pada suhu 37 ºC. Setelah proses
restriksi selesai perlu dilakukan inaktivasi
enzim dengan pemanasan pada suhu 70 ºC.
Hasil pemotongan DNA dengan enzim
restriksi diamati dengan elektroforesis gel
agarosa.
Kloning Kandidat Gen Resistensi Selenium
Ligasi DNA Kromosom ke Dalam DNA
Vektor (pGEM3zf). Ligasi fragmen DNA
asing sebanyak 4 µL ke dalam 1 µL vektor
plasmid pGEM3zf dilakukan menggunakan 1
unit enzim T4 ligase sebanyak 1 µL.
Campuran diinkubasi pada suhu 15 ºC selama
24 jam. Hasil ligasi ini merupakan DNA
plasmid rekombinan yang siap untuk
ditransformasikan ke dalam E coli (Lampiran
4) .
Transformasi ke E.coli dengan DNA
Rekombinan. Transformasi sel kompeten
dilakukan dengan cara mencampurkan DNA
plasmid yang telah diligasi dengan 100 µL sel
kompeten, lalu campuran diinkubasi di dalam
es. Selanjutnya, campuran diberi kejut panas
dengan cara diinkubasi pada suhu 42 ºC. Sel
yang
telah
ditransformasi
selanjutnya
diinkubasikan
dalam
medium
Luria
Bertani(LB) pada suhu 37 ºC untuk memberi
kesempatan bagi sel dalam mengekspresikan
gen marka pada plasmid. Setelah itu, sel
ditebarkan dalam medium selektif.
Seleksi & Identifikasi Sel Rekombinan.
Seleksi transforman dilakukan melalui
pengamatan terhadap koloni yang terbentuk.
Koloni yang terbentuk adalah sel E. coli yang
berhasil ditransformasi. Koloni yang tidak
berhasil ditransformasi akan berwarna biru
akibat adanya penambahan IPTG-X gal dan
mati akibat penambahan antibiotik. Dua jenis
koloni kemungkinan terbentuk pada cawan
Petri.
Koloni
yang
berwarna
putih
menunjukkan sel yang mengandung plasmid
yang berhasil disisipi gen resistensi selenium
namun
koloni
yang
berwarna
biru
mengandung plasmid yang tidak berhasil
disisipi gen resistensi selenium. Setiap koloni
putih yang terbentuk diberi nomor dan
ditandai.
Identifikasi
sel
rekombinan
dilakukan dengan mengisolasi koloni yang
berwarna putih dan ditumbuhkan kembali
dalam media yang mengandung selenium.
Koloni yang resisten terhadap selenium akan
tumbuh menjadi koloni berwarna merah.
Koloni yang berwarna merah diambil agar
dapat diisolasi DNA plasmidnya kembali
dengan metode lisis alkali (Lampiran 3)
kemudian dilanjutkan dengan pengamatan
pada gel elektroforesis agarosa.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi dan Peremajaan Bakteri
Termofilik
Bakteri
termofilik
merupakan
mikroorganisme prokariotik uniseluler yang
hidup dalam sumber air panas di daerah
Pegunungan Rinjani, Kerinci, dan Tana
Toraja. Bakteri termofilik yang digunakan
dalam penelitian ini adalah Geobacillus sp
20k. Bakteri ini hanya diketahui nama