Isolasi Dan Karakterisasi Gen pol Simian
advertisement
4 keparahan pada spesies Macaca asal Asia. Infeksi akibat SRV ditemukan pada Macaca hasil penangkapan dari alam liar dan menjadi endemik pada populasi penangkaran di beberapa pusat penelitian primata Amerika Serikat. Secara genetik, virus SRV ini berkerabat dekat dengan virus MPMV yang sebelumnya telah diisolasi dari sel kanker payudara spesies Macaca. DNA genomik virus SRV yang telah dikarakterisasi mengandung empat gen utama yaitu gen gag, gen env, gen prt dan gen pol (Staheli et al 2006). Serotipe SRV-1 telah berhasil diidentifikasi pada awal tahun 1980 pada kasus infeksi endemik yang terjadi di pusat penelitian primata, California. Virus ini menyerang Macaca cyclopis dan Macaca fascicularis. Serotipe SRV-2 telah berhasil diidentifikasikan pada awal tahun 1980 pada kasus infeksi endemik yang terjadi pada beruk, monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), dan monyet Jepang (Macaca fuscata) di pusat penelitian primata Washington, dan pada monyet rhesus serta Macaca nigra di pusat penelitian primata Oregon (Staheli et al 2006). Perbedaan patogenitas dilaporkan terjadi pada serotipe SRV yang berbeda isolatnya. Perbedaan ini kemungkinan tergantung dari subtipe dari virus dan jenis Macaca yang diinfeksinya. Sebagai contoh adalah isolat SRV-2 yang menyebabkan penurunan kekebalan tubuh yang parah pada Macaca nigra tetapi tidak menimbulkan gejala ketika ditransmisikan pada Macaca mulatta. Isolat SRV-2 lainnya ada yang menyebabkan kekebalan tubuh ringan pada monyet rhesus dan menimbulkan gejala yang fatal terhadap monyet Jepang (Staheli et al 2006). Virion SRV-2 tersusun atas 60% protein, 35% lipid, 3% karbohidrat, dan 2% asam nukleat ([ICTVdB] 2010). Genom SRV-2 terdiri dari 8105 nukleotida. Gen-gen yang terdapat dalam SRV-2 yaitu gag (basa 4942458) yang menyandikan protein gag (group specific antigen), prt (basa 2275-3219) menyandikan protease, pol (basa 3195-5798) yang menyandikan enzim-enzim polimerase, dan env (basa 5820-7562) yang menyandikan envelope glycoprotein. Pada bagian ujungujungnya terdapat daerah Long Terminal Repeat (LTR) yang berukuran sekitar 400 nukleotida (Marracci et al 1999). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi DNA antara lain, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) dari Macaca fascicularis dan Macaca nemestrina asal Indonesia yang positif terinfeksi SRV, phosphate buffer saline (PBS) 1x, proteinase K 20 mg/mL, etanol 95%, QIAmp DNA Mini Kit and DNA Blood mini kit (Qiagen) yang terdiri atas bufer AW1, bufer AW2, dan bufer AE. Bahan yang digunakan untuk teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa adalah, primer (tabel 1), MgCl2 25 mM, dNTPs 10 mM, 10x PCR bufer, Taq polimerase 5U/µL, nuclease free water, agarosa 1.8%, loading dye 6x, bufer Trisacetic EDTA (TAE), Etidium Bromida (EtBr), DNA marker 1 kb, DNA marker 100 bp dan dH20. Bahan yang akan digunakan untuk isolasi DNA dari gel agarosa berdasarkan Qiagen MinElute terdiri atas bufer QG, isopropanol, bufer PE, dan bufer elusi. Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah pipet mikro, vial, barriers tip, pipet serologis, pipet aid, spin kolom, tabung PCR, mesin PCR Perkim Elmer 9700, seperangkat alat elektroforesis gel agarosa, mikrosentrifus, tabung Erlenmeyer, mikrosentrifus, microwave, gelas ukur, waterbath dan vorteks. Selain itu digunakan juga Geldoc Biorad dengan program Quantity One untuk visualisasi dan analisis hasil elektroforesis gel agarosa. Metode Isolasi DNA Total (Qiagen 2003) Sel PBMCs asal Macaca fascicularis dan Macaca nemestrina yang positif terinfeksi SRV (hasil uji amplifikasi PCR gen env 5737U-6243L,Iskandriati 2004) disentrifugasi dengan kecepatan 424 g selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifus dibuang, kemudian Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen pol SRV No Nama Primer Urutan Primer pol SRV- 5'-CACCCCTGTTTGGGTTGATC-3' 1 2 3284 U 5'2 Primer pol SRV- CTAGTGATTACCTTGAGATAAAGGTCC-3' 2 4925 L Tm (oC) 55 %GC 50 54 50 5 pelet ditambahkan PBS 1 mL. Pelet tersebut disentrifugasi kembali dan supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Sebanyak 20 µL proteinase K, 200 µL lisis bufer, dan 200 µL PBS ditambahkan pada pellet, kemudian dicampurkan selama 15 detik. Pemurnian dan pemekatan DNA dilakukan dengan metode QIAmp DNA Mini Kit and DNA Blood Mini Kit dari Qiagen. Pemurnian DNA diawali dengan sel yang telah dilisis diinkubasi pada suhu 56oC selama 10 menit. Pemekatan dilakukan dengan penambahan etanol 95% sebanyak 200 µL pada sel, kemudian dicampurkan. Campuran etanol dan sel darah tersebut dipindahkan ke spin kolom yang sudah memiliki tabung koleksi dan disentrifugasi pada 6780 g selama 1 menit. Sebanyak 500 µL bufer AW1 ditambahkan dan disentrifugasi pada kecepatan 6780 g selama 1 menit. Supernatan dibuang dari kolom, kemudian bufer AW2 ditambahkan 500 µL pada kolom lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10600 g selama 5 menit. Supernatan dibuang dan tabung koleksi diganti dengan tabung Eppendorf. Bufer AE 100 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Tabung tersebut kemudian disentrifugasi 6780 g selama 1 menit. Komponen reaksi yang digunakan adalah 5 µl DNA hasil ekstraksi, masing-masing 0.5 µl primer dengan konsentrasi 10 pmol/µl, 2 µl MgCl2 konsentrasi 25 mM, 2.5 µl 10x TaqGold buffer, 2.5 µl dNTP 10 mM, 0.25 µl TaqGold 5 U/µl, dan dH2O hingga volume reaksi 25 µl. PCR dilakukan dengan tahapan reaksi sebagai berikut. Pertama, semua sampel didenaturasi pada suhu 94C selama 10 menit. Selanjutnya, dilakukan 30 detik denaturasi pada suhu 94C, 30 detik annealing dengan suhu sesuai pada primer yang digunakan, dan 2 menit extension pada suhu 72C sebanyak 40 siklus. Tahapan PCR dilanjutkan dengan post extension pada suhu 72C selama 10 menit, dan diakhiri pada suhu 4C. Konfirmasi hasil PCR akan dilakukan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 1.0% yang mengandung 10 µg/ ml etidium bromida, dijalankan dengan arus listrik 100 Volt selama 45 menit. Penanda DNA yang akan digunakan adalah 1kb plus DNA ladder (Invitrogen). Uji Kuantitas DNA Genomik PBMCs dengan Spektrofotometer Nanodrop Program pengukuran konsentrasi senyawa biomolekul diatur untuk pengukuran konsentrasi DNA. Blanko yang digunakan adalah larutan AE. Larutan AE dimasukkan ke dalam lubang ukur sebanyak 1 µL. Tutup nanodrop dan pilih menu measure blank pada komputer. Lubang ukur dibersihkan terlebih dahulu menggunakan akuades dan tissue. Sampel DNA sebanyak 1 µL dimasukkan ke dalam lubang ukur dengan pipet mikro. Setelah itu, hasil pengukuran akan muncul pada layar komputer dalam konsentrasi ng/µL. Kemurnian DNA juga dapat dilihat langsung dalam perbandingan panjang gelombang A280 dan A260. Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook 1989) Gel agarosa sebanyak 1.0 gram dicampurkan ke dalam larutan bufer TAE 1x. Campuran tersebut kemudian dididihkan, kemudian sebanyak 10 µL EtBr akan ditambahkan pada gel, lalu gel akan dicetak ke dalam alat cetakan agar sampai memadat. Agar yang sudah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis chamber. Sebanyak 2.5 µL larutan loading dye akan dicampurkan dengan 1.5 µL marker 1 kb bp (Invitrogen) dan ditambahkan bufer TAE 1x sampai volumenya menjadi 15 µL. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Sumur antara marker dan sampel diberi jarak satu sumur. Sebanyak 12.5 µL DNA sampel dicampurkan dengan 2.5 µL larutan loading dye lalu dimasukkan ke dalam sumur. Power supply dinyalakan sebesar 100 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis gel diamati dibawah sinar UV GelDoc dengan program Quantity One (Biorad). Amplifikasi Fragmen DNA Gen pol SRV (Sambrook 1989) Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan sepasang primer: primer pol SRV-2 3284U dan primer pol SRV-2 4925L untuk amplifikasi gen pol SRV yang menginfeksi Macaca nemestrina dan Macaca fascicularis. Produk yang dihasilkan adalah sebesar 1641 bp. Primer dirancang berdasarkan basis data genom SRV 2 yang terdapat di Gene Bank. Isolasi dan Pemurnian Amplikon dari Gel Agarosa (Qiagen 2006) Isolasi DNA dan purifikasi dari gel agarosa dilakukan berdasarkan metode MinElute dari Qiagen. Hasil positif elektroforesis gel agarosa 1.0% diambil dari gel keseluruhan. Gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung bertutup ulir yang telah ditimbang bobotnya. Gel dan tabung ditimbang, bobot gel merupakan selisih berat tersebut dengan
