II. ELEKTROFORESIS PADA GEL AGAROSE 2.1 Pendahuluan

II. ELEKTROFORESIS PADA GEL AGAROSE
2.1 Pendahuluan
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi
molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein
dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,
namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan
molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer
massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang
merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang
(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk
memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau
oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,
dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang
memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam
sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan
listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di
dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya.
Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif,
disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar
hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida
atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus.
Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil
sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan
negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan
(staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium
bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat
digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar
ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di
bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif,
autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan
tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan
sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada
akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel
selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti
bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda
(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda
dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan
meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan
sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita
sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding
terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel
agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut
dengan elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di
gel harus diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di
medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif.
Pergerakan kecepatannya tergantung dari :
a. Ukuran molekul DNA
b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan
penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari
sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam
sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan
2.2. Tujuan Pratikum
Dalam praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat membuat gel
agarose dan dapat mengetahui prinsip elektoforesis. Selain itu mahasiswa
juga dapat mengetahui kualitas hasil isolasi plasmid bakteri praktikum
sebelumnya dengan cara spektrofotometer.
2.3 Alat dan Bahan
- Pemanas
- Alat Elektroforesis (cetakan gel dan tangki larutan penyangga elektroda)
- transilluminator UV
- Power Supply
- Erlenmeyer
- Larutan Penyangga TAE 50x
Tris-HCl pH 8,3
2M
Asam asetat pekat
0,99 M
EDTA
50 mM
- Larutan Loading dye
perwarna yang digunakan adalah bromofenol biru.
- Larutan Penyangga
- Larutan EtBr
2.4 Prosedur Kerja
1. Pembuatan gel agarose 1%
- Timbang 0,8 gr agarose + 80 ml TAE 1x
- Didihkan hingga agarose larut
- Dinginkan hingga suhu mencapai 60°C, tuang ke cetakan gel
- Biarkan hingga menjadi padat.
2. Ranning
- Masukkan Gel kedalam Tanki yang berisi buffer TAE 1x
- Campurkan 5ml DNA + 1 ml loading dye
- masukkan kedalam sumur gel, hidupkan arus listrik, 30 menit.
- Angkat gel dan rendam dalam larutan EtBr 10 menit
- Lihat pita DNA diatas UV transmiter
2.5 Hasil dan Pembahasan
DNA dapat ditentukan dengan melakukan migrasi didalam gel agarosa,
agar dapat divisualisasikan maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan
ethidium bromida, kemudian dilihat dengan sinar UV. Ethidium ini akan
mengikat molekul DNA, molekul ethidium bromida ini dapat berenergi tinggi
sehingga dapat merusak sel.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di
medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub
positif. Pergerakan ini kecepatanya tergantung dari ukuran molekul,
kerapatan media, dan arus listrik yang diberikan. Semakin kecil ukurannya,
DNA akan bermigrasi semakin cepat, semakin rapat media yang digunakan,
semakin lambat DNA bermigrasi. Dan semakin besar arus yang diberikan
akan semakin cepat DNA bermigrasi. Sebelum dilkaukan elektroforesis,
suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga muatan perwarna (loading
dye) perwarna yang digunakan adalah bromofenol biru laju migrasi
bromofenol biru dalam gel agarosa (0,5-1,4%) di dalam larutan penyangga
0,5 x TBE kira-kira sebanding dengan laju migrasi DNA utas ganda linear
sebesar 300 pb.
1
6000
4000
6123bp
4226bp
Berdasarkan hasil elektroforesis dengan visualisasi hasil pemendaraan
spektofotometer diatas dapat dilihat Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane)
yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur
merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak
sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul
yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang
sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran
sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul
dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran
molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada
lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut
dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak
pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
log bp
y
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
y = -0.3222x + 4.7538
R² = 0.9938
y
Linear (y)
0
2
4
6
8
x
Grafik persamaan linear hasil elektroforesis
Dilihat persamaan diatas dapat di hitung jarak pita dari sumur sebagai
berikut :
Y= - 0,322 (x) + 4,753
Dimana ;
Y = log bp
X = jarak sumur dengan pita
Maka diketahui jarak pita kedua adalah 6123 bp dari sumur dan pita
ketiga 4226 bp. Sedangkan untuk pita pertama tidak dihitung. Karena berada
di atas marka 10000.
Sedangkan untuk melihat kualitas dari DNA diatas dapat dihitung dengan
pemendaran pada panjang gelombang λ260 dengan absorbansi λ280 dengan
rasio λ260/λ280 sehingga didapat rasion 1,8 yang menunjukan bahwa DNA
hasil isolasi tersebut menunjukan kemurnian 100%. Untuk mengetahui
konsentrasi atau kuantitas dari DNA dapat di gunakan persamaan sebagai
berikut :
λ260 x 50µl x FP
FP= faktor pengenceran
Maka dapat diketahui konsentrasi DNA pada isolasi tersebut adalah 14840
µl/ml.
2.6 Kesimpulan
Dari hasil elektroforesis diatas dapat disimpulkan
1. Untuk memperhatikan penggunaan EtBr dengan baik agar tidak merusak
DNA karena molekulnya berenergi tinggi.
2. Dapat diketahui arah pergerakan DNA, ukurannya dan kecepatanya.
3. Setiap proses elektroforesis di libatkan pula proses spektofotometer
sehingga dapat diketahui keberadaan DNA dan tingkat kemurniannya.