EKOLOGI MIKROBA

V.
KARAKTERISASI GENOTIP
(Genotypic Characterization)
Tahap 4: Elektroforesis gel agarose dari DNA genom
dan PCR-amplified 16S rRNA
Tujuan Praktikum
1. Melakukan identifikasi DNA genom yang telah diisolasi dari spesies
bakteri menggunakan elektroforesis gel agarose.
2. Melakukan identifikasi produk PCR yaitu gen 16S rRNA (PCRamplified 16S rRNA) dari spesies bakteri menggunakan elektroforesis
gel agarose.
3. Memahami konsep dan menguasai cara melakukan elektroforesis gel
agarose.
Teori Ringkas
Elektroforesis melalui gel agarose atau gel polyacrylamide digunakan
untuk tujuan memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA.
Teknik elektroforesis ini sederhana dan cepat dan mempunyai kemampuan
untuk memisahkan fragmen DNA yang tidak dapat dipisahkan dengan
menggunakan teknik lain, misalnya ”density gradient centrifugation”. Lokasi
DNA dalam gel dapat ditentukan secara langsung dengan ”staining”
menggunakan ”fluorescent intercalating dye” (misalnya ethidium bromide
atau SYBR Gold), dan selanjutnya pita dari ”double-standed DNA” dapat
dideteksi dengan menyinari gel dengan UV. Jika perlu, pita DNA ini dapat
diperoleh kembali dari gel dan dapat digunakan untuk tujuan tertentu.
Fragmen DNA sebesar 50-20.000 bp adalah ukuran terbaik yang dapat
dipisahkan oleh gel agarose. Kecepatan pemisahan fragmen DNA menurun
jika panjang DNA meningkat dan kecepatan pemisahannya tergantung pada
voltage aliran listrik yang digunakan.
Metode molekuler yang paling sering digunakan untuk identifikasi
prokariot adalah analisis gen 16S rRNA karena gen ini mempunyai sifat
lestari (conserved). Gen ini tidak mengkode protein tetapi merupakan bagian
RNA struktural dari ribosom (for a structural RNA part of the ribosome).
Karena ribosom berperan penting dalam sintesis protein, maka gen ini selalu
ada dan dimiliki oleh prokariot, dan sangat lestari serta hampir tidak pernah
ditransfer secara horisontal, sehingga menyebabkan gen 16S rRNA ini
sangat ideal untuk rekontruksii pohon filogenetika dan identifikasi prokariot.
Disisi lain, region/daerah yang sangat lestari pada sikuen gen ribosomal RNA
ini akan sangat bermanfaat dan dapat membantu kita dalam
menciptakan/membuat primer-primer universal untuk tujuan mengamplifikasi
gen dari DNA yang diekstrak langsung dari sampel lingkungan.
Agarose adalah polimer linier yang tersusun dari residu D-galaktose dan
L-galaktose. Agarose ini tersedia secara komersial dan diproduksi oleh
bermacam-macam perusahan. Kualitas agarose ini bermacam-macam (dari
kualitas rendah sampai kualitas tinggi) dan kualitas agarose ini sangat
berpengaruh pada suhu ”melting/gelling” larutan agarose, migrasi DNA, dan
kemampuan DNA untuk didapatkan kembali dari gel. Laju migrasi DNA
melalui gel agarose tergantung pada: ukuran (size) molekul DNA, konsentrasi
agarose, bentuk DNA, tegangan volt, jenis agarose, dan buffer elektroforesis.
Tabel 1. Rentang pemisahan fragmen DNA melalui bermacam-macam agarose
Rentang ukuran fragmen DNA melalui bermacam-macam agarose
Agarose
(%)
0.3
0.5
0.8
1
1.2
1.5
2
3
4
6
Agarose
“Standard”
700 bp - 25 kb
500 bp - 15 kb
250 bp - 12 kb
150 bp - 6 kb
80 bp - 4 kb
Agarose
“High gel strength”
800 bp - 10 kb
400 bp - 8 kb
300 bp - 7 kb
200 bp - 4 kb
100 bp - 3 kb
Agarose
“Low gelling/melting
temperature”
800 bp - 10 kb
400 bp - 8 kb
300 bp - 7 kb
200 bp - 4 kb
100 bp - 3 kb
500 bp - 1 kb
Agarose
“Low gelling/melting
temperature and low
viscocity”
500 bp - 1 kb
100 bp - 500 bp
10 bp - 100 bp
Bahan dan alat
- PCR-amplified 16S rRNA dari spesies bakteri
- DNA spesies bakteri
- Pipet eppendoff 0.5-10 uL dan 20-200 uL
- Tip kuning (2 uL) dan tip putih (2 uL)
- Chamber elektroforesis dan asesorisnya
- Baskom untuk es dan es
- Tube eppendoff (1.5 mL)
- Parafilm
- TAE (Tris-acetate and EDTA) 1X
- 100 mL Gel Agarose 1%
- 10X loading buffer
- 5 ug/mL ethidium bromide
2
-
Marker (1 kb DNA Ladder atau 100 bp DNA Ladder)
PROSEDUR PRAKTIKUM:
1. Cairkan gel agarose 1% menggunakan microwave
2. Tuangkan gel agarose 1% yang telah cair secukupnya (jangan terlalu
tebal, kira-kira 0.5 cm) pada tray elektroforesis yang telah disediakan
dimana telah diletakkan ”comb” yang mempunyai 14 sumur.
3. Biarkan gel agarose tersolidifikasi (30 menit).
4. Potong parafilm secukupnya dan load 5 uL produk PCR atau DNA
dan 2 uL 10X loading buffer pada parafilm tersebut untuk setiap
produk PCR atau DNA dari setiap spesies bakteri.
5. Letakkan gel agarose tersolidifikasi pada chamber elektroforesis dan
tuang TAE (Tris-acetate and EDTA) 1X secukupnya sampai menutupi
gel agorose tersebut.
6. Load 7 uL campuran DNA atau produk PCR+10X loading buffer dari
masing-masing sampel DNA atau produk PCR menggunakan pipet
pada tiap sumur di gel agarose.
7. Setelah semua sampel DNA atau produk PCR selesai di-load, run
elektroforesis gel agarose pada 75 – 100 Voltage selama 30-90
menit.
8. Ambil gel agarose dan staining gel tersebut dalam 1X TAE + 5 ug/mL
ethidium bromide selama 10-20 menit dan angkat serta kemudian
dibilas dengan air akuades.
9. Ambil PC gambar dari gel tersebut.
Catatan :
Harap selalu menggunakan sarung tangan selama praktikum.
Pertanyaan :
1. Jelaskan konsep kerja elektroforesis gel agarose!
2. Sebutkan alasan-alasan mengapa gen 16S RNA digunakan untuk
identifikasi prokariot!
3. Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi laju migrasi DNA
melalui gel agarose!
3