EKOLOGI MIKROBA

VI. KARAKTERISASI GENOTIP
(Elektroforesis gel dari PCR-amplified 16S rRNA )
Tujuan Praktikum
1. Melakukan identifikasi produk PCR yaitu gen 16S rRNA (PCRamplified 16S rRNA) dari spesies bakteri menggunakan elektroforesis
gel agarose.
2. Memahami konsep dan menguasai cara melakukan elektroforesis gel
agarose.
Teori Ringkas
Metode molekuler yang paling sering digunakan untuk identifikasi
prokariot adalah analisis gen 16S rRNA karena gen ini mempunyai sifat
lestari (conserved). Gen ini tidak mengkode protein tetapi merupakan bagian
RNA struktural dari ribosom (for a structural RNA part of the ribosome).
Karena ribosom berperan penting dalam sintesis protein, maka gen ini selalu
ada dan dimiliki oleh prokariot, dan sangat lestari serta hampir tidak pernah
ditransfer secara horisontal, sehingga menyebabkan gen 16S rRNA ini
sangat ideal untuk rekontruksii pohon filogenetika dan identifikasi prokariot.
Disisi lain, region/daerah yang sangat lestari pada sikuen gen ribosomal RNA
ini akan sangat bermanfaat dan dapat membantu kita dalam
menciptakan/membuat primer-primer universal untuk tujuan mengamplifikasi
gen dari DNA yang diekstrak langsung dari sampel lingkungan.
Agarose adalah polimer linier yang tersusun dari residu D-galaktose dan
L-galaktose. Agarose ini tersedia secara komersial dan diproduksi oleh
bermacam-macam perusahan. Kualitas agarose ini bermacam-macam (dari
kualitas rendah sampai kualitas tinggi) dan kualitas agarose ini sangat
berpengaruh pada suhu ”melting/gelling” larutan agarose, migrasi DNA, dan
kemampuan DNA untuk didapatkan kembali dari gel. Laju migrasi DNA
melalui gel agarose tergantung pada: ukuran (size) molekul DNA, konsentrasi
agarose, bentuk DNA, tegangan volt, jenis agarose, dan buffer elektroforesis.
Tabel 1. Rentang pemisahan fragmen DNA melalui bermacam-macam agarose
Rentang ukuran fragmen DNA melalui bermacam-macam agarose
Agarose
(%)
0.3
0.5
0.8
1
1.2
1.5
2
3
4
6
Agarose
“Standard”
700 bp - 25 kb
500 bp - 15 kb
250 bp - 12 kb
150 bp - 6 kb
80 bp - 4 kb
Agarose
“High gel strength”
800 bp - 10 kb
400 bp - 8 kb
300 bp - 7 kb
200 bp - 4 kb
100 bp - 3 kb
Agarose
“Low gelling/melting
temperature”
800 bp - 10 kb
400 bp - 8 kb
300 bp - 7 kb
200 bp - 4 kb
100 bp - 3 kb
500 bp - 1 kb
Agarose
“Low gelling/melting
temperature and low
viscocity”
500 bp - 1 kb
100 bp - 500 bp
10 bp - 100 bp
Bahan dan alat
- PCR-amplified 16S rRNA dari spesies bakteri
- Pipet eppendoff 0.5-10 uL
- Tip kuning (2 uL) dan tip putih (2 uL)
- Chamber elektroforesis dan asesorisnya
- Baskom untuk es dan es
- Tube eppendoff (1.5 mL)
- Parafilm
- TAE (Tris-acetate and EDTA) 1X
- 100 mL Gel Agarose 1%
- 10X loading buffer
- 5 ug/mL ethidium bromide
- Marker (1 kb DNA Ladder atau 100 bp DNA Ladder)
PROSEDUR PRAKTIKUM:
1. Cairkan gel agarose 1% menggunakan microwave
2. Tuangkan gel agarose 1% yang telah cair secukupnya (jangan terlalu
tebal, kira-kira 0.5 cm) pada tray elektroforesis yang telah disediakan
dimana telah diletakkan ”comb” yang mempunyai 14 sumur.
3. Biarkan gel agarose tersolidifikasi (30 menit)
4. Potong parafilm secukupnya dan load 4 uL produk PCR dan 2 uL 10X
loading buffer pada parafilm tersebut untuk setiap produk PCR dari
setiap spesies bakteri.
2
5. Letakkan gel agarose tersolidifikasi pada chamber elektroforesis dan
tuang TAE (Tris-acetate and EDTA) 1X secukupnya sampai menutupi
gel agorose tersebut.
6. Load 6 uL campuran produk PCR+10X loading buffer dari masingmasing sampel produk PCR menggunakan pipet pada tiap sumur di
gel agarose
7. Setelah semua sampel produk PCR selesai di-load, run elektroforesis
gel agarose pada 75 – 100 Voltage selama 20-30 menit.
8. Ambil gel agarose dan staining gel tersebut dalam 1X TAE + 5 ug/mL
ethidium bromide selama 10 menit dan angkat serta kemudian dibilas
dengan air akuades
9. Ambil PC gambar dari gel tersebut.
Catatan :
Harap selalu menggunakan sarung tangan selama praktikum.
Pertanyaan :
1. Sebutkan alasan-alasan mengapa gen 16S RNA digunakan untuk
identifikasi prokariot!
2. Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi laju migrasi DNA
melalui gel agarose!
3