Deteksi DNA Seara Visual Dengan Teknik

Deteksi DNA Seara Visual Dengan Teknik Elektroforesis
Laurencius Sihotang
I. Tujuan
1. Mempelajari
2. Mendeteksi DNA yang telah di isolasi dengan teknik spektrofotometrik
2. mengetahui konsentrasi dan jumlah DNA
II. Kajian Pustaka
Teknik Elektroforesis
Prinsip teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan
dibawah pengaruh medan elektronik dalam kondisi yang konstan. Elektroforesis DNA
memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik
molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa
dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga 20.000 pasang basa (bp).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran
molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmenfragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya.
Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah
terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara
lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium
bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (media UV-transilluminator).
III. Alat dan Bahan
 Alat
1. Elektroforesis
2. Sisir pembentuk sumur pada gel
3. Pemasok daya
4. Transimuloator dan sinar ultraviolet
 Bahan
1.
2.
3.
4.
Bubuk gel agarose
Larutan etidium bromide 10 mg/mL
Larutan elektroforesis TAE
Larutan zat pewarna/loading buffer
IV. Cara Kerja
 Pembuatan Gel Agarose 1%
Pengenceran larutan TAE dari 10% menjadi 1% dengan rumus m 1v1 = m2v2,
volume TAE 1% yang akan dibuat adalah 250 mL. Ukur larutan tae sebanyak 25 mL
kemudian tambahkan akuades hingga volumnya menjadi 250 mL, sehingga
diperoleh larutan TAE 1%. Untuk membuat agarose campurkan TAE 1% sebanyak
40 mL dengan agar 0,4 gram. Aduk sampai merata dan panaskan pada microwave.
Setelah itu tuangkan larutan agarose tersebut kedalam cetakan yang sudah
disiapkan dengan lengkap dengan sisir pembuat sumur pada agarose. Diamkan
beberapa saat sampai agarose dingin dan mengeras. Sisa TAE 1% akan digunakan
dalam proses elektroforesis.

Elektroforesis
Setelah agarose mengeras, dilepaskan dari cerakan dan sisir pembentuk
sumurnya juga dilepaskan. Kemudian agarose diletakkan ke dalam elektroforesis,
setelah itu bagian kanan dan kiri di isi dengan larutan TAE 1% sampai menggenangi
agarose yang berperan sebagai cairan elektrolit. Ambil sampel DNA sebanyak 1μL,
kemudian campurkan dengan larutan zat pewarna/loading buffer 1μL.
Setelah dicampur merata antara sampel DNA dan loading buffer masukkan ke
dalam sumur pada agarose dengan menggunakan mikropipet tanpa merobek
agarose. Apabila semua sampel DNA sudah dimasukkan kedalam sumur agarose,
elektroforesis dihubungkan dengan sumberdaya dan dinyalakan pada tegangan 90
volt selama 30 menit. Langkah selanjutnya adalah ambil agarose dari elektroforesis,
analisis dengan di atas transimulator sinar ultraviolet. Sampel yang terdapat DNA
genomnya akan terlihat berpendar.
V.
Hasil
Genom yang sudah berhasil di isolasi dari sampel darah kemdian diuji dengan
elektroforesis dan diperoleh hasil sebagai berikut:
Sumur Gel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
No. Sampel darah
Deteksi DNA
-
Tabel 2. Hasil Elektroforesis Isolasi Genom Darah ke-1
Keterangan:
Agarose sebanyak 1 %
Waktu : 30 menit
Daya
: 90 volt
Gambar 2. Elektroforesis Genom pertama
*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan
seterusnya
Sumur Gel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
No. Sampel darah
3
17
4
6
7
9
13
Marker
3
4
6
Deteksi DNA
+
+
+
-
Tabel 3. Hasil Elektroforesis Isolasi Genom Darah ke-2
Keterangan:
Agarose sebanyak 0,9 %
Waktu : 25 menit
Daya
: 90 volt
Sumur gel no 9, 10, 11 merupakan hasil PCR
Sumur Gel No 12, 13, 14, 15 rusak sehingga tidsak dapat digunakan
Berpendar
Gambar 3. Elektroforesis Genom dan hasil PCR pertama
*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan
seterusnya
Hasil Elektroforesis Isolasi DNA darah yang kedua yang sudah di PCR dan terlihat
pendaran pada sumur 1, 4, dan 5 tetapi mengarah dengan jalur terbalik.
VI.
Pembahasan
Setelah dilakukan elektroforesis diperoleh hasil seperti diatas, dimana
pengujian pertama tidak ada terdeteksi genom hasil isolasi. Kemungkinan penyebab
tidak terlihatnya genom dari uji pertama adalah waktu untuk pengujian
elektroforesis terlalu lama lebih dari 30 menit. Selain itu daya pada leketroforesis
juga terbalik, sehingga pergerakan genom menjadi terbalik dimana jalur yang pendek
bermuatan negatif dan jalur panjangnya positif. Dengan terbaliknya sumber daya
listrik tersebut mengakibatkan genom berjalan terbalik. Dengan waktu yang panjang
dan jalur genom dalam agarose pendek memungkinkannya genom sudah melewati
agarose sehingga tidak ada yang terlihat tampak pada saat diamati dibawah
Transimuloator sinar ultraviolet (UV).
Hasil yang diperoleh tersebut sangat tidak memuaskan, hal itu mungkin
terjadi akibat seperti dijelaskan diatas sehingga dilakukan pengujian ulang, akan
tetapi ada beberapa sampel yang genom hasil isolasi tersebut masih banyak terdapat
darah/protein sehingga dilakukan kembali pemurnian dengan memberikan
isoplropanol sehingga hanya tabung 2, 4, 6, 7, 9, 13 dan 14 yang di uji kembali. Akan
tetapi karena sumur gel ada 15 dengan memikirkan efesiensi dilakukan juga
elektroforesis terhadap DNA hasil PCR pertama yaitu sampel tabung nomor 3, 4 dan
6.
Setelah melakukan elektroforesis kedua terhadap genom, dan di amati diatas
transimulator UV diperoleh hasil seperti diatas. Cukup membuat lega karena sampel
tabung nomor 3, 6 dan 7 terlihat pendaran genom saat diamati di transimulator UV
dengan arah yang terbalik. Untuk sampel lain yang tidak terlihat kemukinan yang
terjadi human eror yaitu pada saat pengambilan sampel dr tabung sampel kurang
tepat atau memang pada saat isolasi genom tidak berhasil. Hal lain yang dapat
menyebabkan kegagalan seperti faktor praktikan belum terbiasa melakukan
praktikum yang membutuhkan ketelitian serta keakuratan pengisian bahan serta
perlunya waktu yang lebih lama agar dapat menghasilkan isolate yang terbaik serta
maksimal. Kesalahan selanjutnya dapat terjadi pada saat melakukan langkah kerja,
misalnya langkah kerja yang kurang tepat, atau adanya kontaminasi sehingga DNA
yang seharusnya diambil supernatannya tetapi malah ikut terbuang bersama hasil
sentrifugasi yang tidak diinginkan.
Akan tetapi yang cukup membuat bingung adalah sampel tabung nomor 3
dan tabung nomor 6 genom terlihat berpendar, akan tetapi pada sampel nomor
tersebut hasil PCR tidak ada pendaran. Kemungkinan penyebabnya adalah DNA yang
diamplifikasi cukup sedikit dan kemungkinan lain adalah kurang sensitifnya hasil uji
PCR. Hal inilah yang menumbuhkan harapan masih bisa dilanjutkan ke tahap
selanjutnya.
VII.
Kesimpulan
Hasil uji genom pertama tidak tampak berpendar diatas transimulator UV,
kemungkinan penyebabnya adalah terlewatnya genom pada agarose karena sumber
daya yang terpasang terbalik. Hal ini diperkuat dengan uji elektroforesis kedua
dimana diperoleh hasil sampel nomor 3, 6 dan 7 terdapat pendaran genom.
Daftar Acuan
 Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. 2009. Essentials of Medical Genomics. Second ed.
John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, USA.
 Campbell, A. N. J. B. Reece & L. G. Michell. 2012. Biologi. Edisi 8 jilid 1. terj. Erlangga.
Jakarta
 Cohn Robert m., Roth Karl s. 1996. Biochemistry and Disease. William and Wilkins,
Inc. Maryland
 Jamilah. 2005. Pengaruh pemberian macam deterjen, penambahan enzim dan
ekstrak nanasterhadap hasil isolasi DNA berbagai macam buah. Universitas
Negeri malang. Malang
 McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR. Second ed. Taylor & Francis Group.
Madison Avenue, NY, US.
 Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase
Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed:
Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.