bab iii bahan dan metode penelitian

BAB III
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
III.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2010 hingga bulan Februari
2012 di Kandang Animal Facility Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian
Bogor dan Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan
Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
III.2. Bahan dan Alat
Tepung daging teripang berasal dari teripang pasir (Holothuria scraba)
yang disiapkan di Laboratorium Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut
Pertanian Bogor. Bahan lain yang digunakan yaitu sekam sebagai alas kandang,
pakan tikus berupa pelet, larutan fisiologis berupa NaCl 0.9%, methanol, larutan
giemsa 10%, eter dan akuades. Alat yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu
kandang tikus yang terbuat dari plastik, jaring kawat penutup kandang, botol
minum tikus, gelas objek, mikroskop, spoit 1cc dengan sonde lambung dari
stainless steel, cotton bud, tisu, kapas, kertas label, dan timbangan digital.
III.3. Hewan Coba dan Pemeliharaannya
Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih betina
(Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley usia 3 bulan pada awal penelitian.
Tikus percobaan dikandangkan secara individu dalam bak plastik yang berukuran
(40x30x15) cm3 dengan menggunakan kawat untuk menutupi bagian atas
kandang. Dalam menjaga kebersihan dan kesehatan, kandang dialasi dengan
menggunakan sekam yang diganti 3 hari sekali. Kandang juga dilengkapi dengan
botol air minum dan tempat pakan. Pakan dan minum diberikan ad libitum.
III.4. Pelaksanaan Penelitian
III.4.1. Pengelompokan Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan adalah 12 ekor tikus betina yang terdiri dari
10 ekor hewan yang sudah diangkat ovariumnya (hewan ovariektomi) dan dua
19
ekor hewan normal. Semua hewan dibagi ke dalam 6 kelompok yaitu: 1).
Kelompok K, merupakan kelompok kontrol, yaitu tikus yang tidak diovariektomi
dan tidak diberi perlakuan apapun, 2). Kelompok OK, merupakan kelompok
kontrol perlakuan adalah hewan yang diovariektomi tetapi tidak diberi perlakuan
apapun, 3). Kelompok EST, merupakan kelompok kontrol positif, adalah tikus
yang telah diovariektomi dan diberi estrogen murni dengan dosis 0,02 µg/100 g
BB 4). Kelompok TD 30, merupakan kelompok tikus yang telah diovariektomi
dan diberi tepung daging teripang dengan dosis 30 µg/100 g BB, 5). Kelompok
TD 40, merupakan kelompok tikus yang telah diovariektomi dan diberi tepung
daging teripang dosis 40 µg/100 g BB, dan 6). Kelompok TD 50, merupakan
kelompok tikus yang telah diovariektomi dan diberi tepung daging teripang dosis
50 µg/100 g BB.
III.4.2. Perlakuan
Tepung daging teripang dan estrogen diberikan dengan volume 2 ml dan
dilakukan secara pencekokan (force feeding) yang dilaksanakan setiap hari selama
20 hari berturut-turut. Pengambilan data untuk menentukan panjang siklus estrus
dengan cara melakukan ulas vagina. Ulas vagina dilakukan 3 (tiga) kali sehari,
yaitu pada pagi hari (pukul 05.00 WIB), siang hari (pukul 13.00 WIB), dan malam
hari (pukul 21.00 WIB) selama 15 hari berturut-turut dimulai dari H-5
pencekokan (Gambar 5).
Pencekokan (20 hari)
Adaptasi Tikus
(7 hari)
I
I
-7
(7 hari)
Tikus
masuk
I
I
Ulas Vagina ( 15 hari)
I
I
I
I
1
I
5
I
20
(5 hari)
Tikus
mulai
dicekok
(15 hari)
Tikus mulai
diulas vagina
Gambar 5 Diagram pelaksanaan penelitian.
20
III.4.3. Pengamatan
Pengambilan ulas vagina dilakukan dengan menggunakan cotton bud yang
telah direndam dalam NaCl fisiologis 0.9% sesaat sebelum digunakan, kemudian
diulaskan pada dinding vagina dengan diputar 360º. Hasil ulasan dioleskan secara
merata pada gelas objek, difiksasi dengan methanol selama 5 menit dan diwarnai
dengan Giemsa 10% selama 30 menit, preparat tersebut selanjutnya dicuci dengan
air mengalir perlahan dan dikering anginkan. Untuk menetapkan siklus estrus
preparat diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x10 dan 40x10.
Penentuan fase siklus estrus dari hasil ulas vagina dilakukan berdasarkan
keberadaan sel-sel epitel vagina dan jumlah kuantitatif sel-sel epitel vagina.
Perbandingan jenis sel pada preparat ulas vagina dan tahapan fase pada siklus
estrus dituangkan pada Tabel 3 dan Gambar 6.
Tabel 3 Perbandingan jenis sel pada preparat ulas vagina
Fase siklus berahi
Proestrus
Estrus
Metestrus
Diestrus
Ulasan vagina
Sel epitel berinti ± 75%
Sel kornifikasi (sel tanduk) ± 25%
Sel kornifikasi ± 75%
Sel pavement (menumpuk) ± 25%
Sel pavement 100%
Sel pavement dan leukosit
Leukosit 100%
Leukosit dan sel berinti mulai muncul
Sumber : Baker et al. (1980)
b
a
a
Sel epitel berinti
Sel kornifikasi
Sel kornifikasi
Sel pavement
c
d
Leukosit
Sel pavement
Leukosit
Gambar 6 Gambaran mikroskopis fase estrus ulas vagina pada tikus (Hill 2006)
(Keterangan : Perbesaran 10x)
21
III.4.4. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan ANOVA, dan jika
terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji lanjut (Duncan Test)
(Sudjana 2001).