KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN
DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH
DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS
Test Seleksi Calon Peserta
International Biology Olympiad (IBO) 2014
2–8 September 2013 Bandung, Jawa Barat TES PRAKTIKUM 1 Tugas III Isolasi Plasmid dan Analisis Restriksi Enzim
Durasi: 40 Menit www.tobi.or.id Nama: ......................................................................................................... Asal SMA/Kelas: ....................................................................................... Seleksi Calon Peserta IBO 2014 OSN 2013 Praktikum Biologi Sel dan Molekuler Tugas III Isolasi Plasmid dan Analisis Restriksi Enzim Dr. Wibowo adalah seorang peneliti yang sedang melakukan penelitian untuk mengisolasi dan
mengarakterisasi gen GFP (green fluorescence protein) yang panjangnya 750 pb. Dia telah
berhasil mengisolasi dan kemudian menyisipkan gen GFP tersebut ke dalam suatu vektor
kloning pGEM-T easy (3000 pb) pada daerah pemotongan enzim restriksi EcoRI. Gen GFP
tersebut kemudian diperbanyak secara in vivo dalam bakteri E. coli. Sebelum dipergunakan
untuk analisis lebih lanjut, Dr. Wibowo ingin memastikan bahwa bakteri E. coli yang telah
ditransformasi telah benar-benar mengandung plasmid pGEM-T easy berisi gen GFP.
Tugas:
Pada percobaan ini anda diberikan endapan (pelet) bakteri transforman dan akan melakukan
konfirmasi keberadaan gen GFP dalam vektor kloning pGEM-T easy menggunakan metode
analisis restriksi. Untuk keperluan tersebut anda akan melakukan isolasi plamid dari E. coli
transforman berisi plasmid rekombinan yang telah dikultur oleh Dr. Wibowo, kemudian
dilanjutkan dengan pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoRI fast
digest. Plasmid rekombinan yang dipotong tersebut akan menghasilkan dua pita DNA linier
dengan ukuran 3000 pb dan 750 pb.
1. Waktu ujian isolasi plasmid dan analisis restriksi enzim adalah 40 menit.
2. Sentrifugasi pertama akan dimulai 7 menit sejak tes dimulai.
3. Bacalah protokol yang diberikan dengan baik. Waktu menunggu sentrifugasi dapat anda
gunakan untuk menyiapkan alat/bahan untuk tahapan setelahnya.
4. Sentrifugasi hanya dilakukan pada saat tertentu dan akan diingatkan secara berkala oleh
asisten. Waktu antar sentrifugasi terbatas, jadi gunakan waktu luang anda sebaik mungkin.
Tertinggal sentrifugasi menyebabkan nilai anda untuk praktikum “isolasi plasmid dan
analisis restriksi enzim” Biologi Sel dan Molekuler = 0.
5. Jangan lupa memberi label No meja pada sampel hasil isolasi.
6. Saat proses sentrifugasi dan inkubasi, anda wajib memberikan sample kepada asisten dan
setelah selesai sentrifugasi/ inkubasi asisten yang akan menyerahkan sample ke meja
anda masing-masing.
1 Nama: ......................................................................................................... Asal SMA/Kelas: ....................................................................................... Seleksi Calon Peserta IBO 2014 OSN 2013 Praktikum Biologi Sel dan Molekuler Penilaian:
-­‐ Berhasil menyelesaikan semua tahapan isolasi plasmid. Nilai = 10
-­‐ Hasil elektroforesis sampel analisis restriksi.
o Plasmid terpotong seluruhnya dan terlihat 2 buah pita (3000 bp dan 750 bp) tampak
jelas: 30 poin
o Plasmid terpotong hanya sebagian (partial digest): 15 poin
o Plasmid tidak terpotong/ tidak ada pita DNA: 0 poin
-­‐ Kebersihan; peserta yang tidak membuang sampah tips, mikrotube, tissue pada plastik
sampah dikenakan pengurangan nilai 10 poin
-­‐ Peserta yang bersikap tidak wajar dan mengganggu kelancaran tes dikenakan pengurangan
nilai 10 hingga sanksi maksimal diskualifikasi.
Alat dan Bahan:
1. Endapan bakteri transforman E. coli: 1 tube
2. PD column dan Collection tube @ 1 buah
3. Mikrotube 1,5 mL kosong: 2 buah (1 untuk isolasi plasmid dan 1 untuk analisis restriksi)
4. Buffer isolasi plasmid: PD1 buffer (220 µL), PD2 buffer (220 µL), PD3 buffer (320 µL),
Wash buffer (620 µL), Elution buffer/TE (60 µL)
5. Analisis restriksi enzim: Enzim EcoRI fast digest (1,5 µL), Buffer FD (1,5 µL), dan Nuclease
Free Water/ NFW (10 µL)
6. Mikropipet 100-1000, 10-100, dan 0.5-10
7. Tips (Biru 8 buah, kuning 4 buah, putih 8 buah)
8. Plastik sampah
9. Gabus
10. Tissue
11. Sentrifuga: di meja asisten
12. Penangas 37 0C dan 80 0C: di meja asisten
Alat dan bahan hanya diberikan sesuai dengan jumlah yang tertera di atas.
Peserta tidak diperkenankan meminta tambahan alat maupun bahan kepada
asisten.
2 Nama: ......................................................................................................... Asal SMA/Kelas: ....................................................................................... Seleksi Calon Peserta IBO 2014 OSN 2013 Praktikum Biologi Sel dan Molekuler Isolasi Plasmid
Protokol:
Label No. Meja ditulis dibagian atas mikrotube
3,5 menit 1. Tambahkan 200 µL PD1 buffer ke dalam pelet. Resuspensi sel dengan pipet.
2. Sampel hasil resuspensi, tambahkan 200 µL PD2 buffer. Bolak-balik tabung
10x
3. Setelah sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit, Tambahkan 300
µL PD3 buffer. Bolak-balik tabung 10x. Serahkan sampel anda ke asisten
4. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 3 menit. Sampel anda akan dikembalikan
oleh asisten berdasarkan No. meja yang tertera di atas tabung mikrotube
5. Letakkan PD column diatas 2 mL collection tube, seperti gambar di bawah
ini
Label bagian atas PD column dengan No meja anda
1,5 menit 1,5 menit 6. Pindahkan 600 µL supernatan (cairan bening) dari langkah 4 ke dalam PD
column. Serahkan sampel anda (PD column dan collection tube) ke asisten.
7. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 30 detik. Sampel anda akan dikembalikan
oleh asisten berdasarkan No. meja yang tertera di atas PD column
8. Buang cairan sisa pada collection tube. Tempatkan kembali PD column
pada collection tube
9. Tambahkan 600 µL Wash buffer ke dalam PD column. Serahkan sampel
anda (PD column dan collection tube) ke asisten.
10. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 3 menit. Sampel anda akan dikembalikan
oleh asisten berdasarkan No. meja yang tertera di atas PD column
3 Nama: ......................................................................................................... Asal SMA/Kelas: ....................................................................................... Seleksi Calon Peserta IBO 2014 OSN 2013 Praktikum Biologi Sel dan Molekuler 11. Buang collecting tube anda beserta cairan sisanya. Tempatkan PD column
pada mikrotube kosong seperti gambar di bawah ini.
3 menit Labeli bagian atas mikrotube dengan No Meja Anda
12. Tambahkan 50 µL elution buffer atau TE di bagian tengah atas matrix PD
column
13. Diamkan selama 1 menit, agar larutan TE diserap oleh matrix. Serahkan
sampel anda (PD column dan collection tube) ke asisten.
14. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 2 menit. Sampel plasmid anda diharapkan
terelusi dalam 50 µL TE dan terkoleksi pada mikrotube
Pekerjaan isolasi DNA plasmid Anda telah selesai. Segera lanjutkan dengan analisis
restriksi menggunakan enzim EcoRI mengikuti protokol di halaman berikutnya.
4 Nama: ......................................................................................................... Asal SMA/Kelas: ....................................................................................... Seleksi Calon Peserta IBO 2014 OSN 2013 Praktikum Biologi Sel dan Molekuler Analisis Restriksi Enzim
Label sampel ditulis dibagian atas mikrotube
1. Lakukanlah konfirmasi hasil isolasi plasmid anda dengan pemotongan
plasmid menggunakan enzim restriksi EcoRI, dengan reaksi sebagai
berikut :
Komponen
4 menit NFW
Konsentrasi
Awal
-
Konsentrasi
Akhir
-
Volume yang
diambil
…
10×
-
1×
-
…
3 µL
10 Unit
Total
1 Unit
…
10 µL
(Hingga 10 µL)
Buffer FD
Template DNA
plasmid
Enzim EcoRI
Hitunglah volume masing-masing komponen untuk reaksi restriksi
diatas dan tuliskan pada kolom yang tersedia.
2. Masukkan seluruh komponen analisis restriksi diatas di dalam
mikrotube yang telah disediakan dan campurkan hingga homogen
menggunakan mikropipet dan tips.
3. Asisten: Inkubasi selama 5 menit pada suhu 370C.
4. Asisten: Setelah inkubasi 370C dilakukan, inaktivasi reaksi restriksi
pada suhu 800C selama 5 menit.
Pekerjaan Anda telah selesai, segera berikan mikrotube berisi hasil
restriksi anda kepada asisten.
5