III. METODE A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah

III. METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Februari hingga Juni 2015 di
Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Lampung, UPT LaboratoriumTerpadu dan Sentra
Inovasi Teknologi Universitas Lampung serta Laboratorium Mikrobiologi
RSUDAM Provinsi Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat- alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoclave (All American),
laminar air flow (Esco), mikroskop(Olympus), timbangan digital (Acis),
inkubator, mikrosentrifuga (Thermo), magnetic stirer, hotplate, tabung sentrifuga,
mikropipet berbagai ukuran 5 µl, 10µl, 200µl dan 500 µl (Bio-Rad), tips
mikropipet (Biologix), vortex(Genie Z), microwave, oven, aparatus elektroforesis
horizontal (Bio-Rad), perangkat elektroforesis (Advance Mupid- ex), UV
transiluminator (Bio-Rad), lemari pendingin (sharp), freezer suhu -20°C, shaker
orbital inkubator (GFL 109), sarung tangan, masker, parafilm (Sigma),
mikrometer, kasa, kapas, rak tabung, jarum ose, dan alat-alat gelas lain seperti
tabung reaksi, cawan petri, Erlenmeyer, beaker gelas, gelas ukur, labu ukur, pipet
tetes, batang pengaduk, dan pemanas bunsen.
36
Adapun bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah larutan salin
steril, BaCl22H2O, H2SO4, disk yang mengandung antibiotik : ampicillin (10
mcg), amikasin (30 mcg), trimetropim (5 mcg), ceftriaxone(30 mcg), cefotaxime
(30 mcg), cefixime (5 mcg), aztreonam (30 mcg) dan siprofloxacine (5 mcg),
Reagen Kovacks, Mac Conkey (MC) Agar, Muller Hinton Agar (MHA) plate,
Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Simon Citrat (SC), Urea, Sulfur Indol Motility
(SIM) medium, yeast ekstrak, tryptone, NaCl, Natrium Ampisillin, Gliserol 40%,
akuadest steril , Mini Plasmid Kit Presto TM (Geneaid), agarosa powder
(Invitrogen), buffer TBE 10X (Ultrapure), etidium bromida (Syber Safe), loading
dye (Invitrogen), dan penanda DNA 1kb (Geneaid).
Sedangkan bahan pemeriksaan yang digunakan adalah isolat Escherichia coli
yang diisolasi dari urin penderita infeksi saluran kemih.
C. Prosedur Penelitian
1. Tahap Persiapan
a. Persiapan Alat
Semua peralatan gelas dicuci bersih, dikeringkan dan dilakukan sterilisasi
agar alat-alat tersebut terhindar dari mikroba yang tidak diinginkan.
Sterilisasi alat dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121°C
dengan tekanan 1 atm selama 20 menit. Sebagian besar kegiatan dilakukan
secara aseptik di dalam laminar air flow.
b. Pembuatan larutan, buffer, dan media
Cara pembuatan larutan, buffer, dan media yang digunakan dalam penelitian
adalah
37
Mac Conkey (MC) agar : Ditimbang 50 g MC agar, dilarutkan dalam 1 L
air suling dan dipanaskan di hot plate sampai larut sempurna, kemudian
disterilkan di autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit, setelah steril
dituang ke cawan petri sebanyak 15-20 mL.
Muller Hinton Agar ( MH) agar : Ditimbang 38 g MH agar, dilarutkan
dalam 1 L air suling dan dipanaskan di hot plate sampai larut sempurna,
kemudian disterilkan di autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit,
setelah steril dituang ke cawan petri sebanyak 15-20 mL.
Triple Sugar Iron (TSI) Agar : 65 g serbuk media TSI Agar dilarutkan
dengan 1 L air suling, lalu dipanaskan di hot plate sampai larut sempurna,
setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10 mL, kemudian
disterilkan di autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit, dibiarkan
membeku pada posisi miring.
Simon Citrat (SC) : Ditimbang 22 g SC, dilarutkan dalam 1 L air suling.
lalu panaskan di hot plate sampai larut sempurna, setelah itu dimasukkan ke
dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian disterilkan di autoclave pada
suhu 121°C selama 15 menit, dibiarkan membeku pada posisi miring.
Sulfur Indol Motility (SIM) : 30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan
1 L air suling, dipanaskan hingga melarut di hot plate, setelah itu
dimasukkan ke tabung reaksi sebanyak 5 mL, disterilkan dengan autoclave
selama 15 menit pada suhu 121°C kemudian dibekukan.
Urea Agar : 24,02 g serbuk media Urea Agar dilarutkan dengan 1 L air
suling, disterilkan dengan autoclave selama 20 menit pada suhu 121°C,
38
kemudian di tempat terpisah, larutkan 400 g Urea dalam 1 L air suling,
disterilkan dengan penyaringan, secara aseptik dicampurkan 50 mL larutan
urea ke dalam 95 mL larutan urea agar, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
sebanyak 5 mL dan dibiarkan membeku dalam posisi miring.
NaCl 0,85% steril : Ditimbang 0,85 g NaCl, dilarutkan dalam 100 mL air
suling kemudian dibagikan kedalam tabung masing- masing 3 mL,
selanjutnya disterilkan selama 20 menit pada suhu 121°C.
Standar Mac Farlan ( Standar Kekeruhan ) : Dipipet 0,5 mL larutan
BaCl22H2O 1,175% ditambahkan 99,5 mL H2SO4 1%, dimasukan dalam
tabung bertutup rapat.
Reagen Kovacks : Ditimbang 5 g para dimethyl amino benzaldehyde,
dilarutkan kedalam 75 mL amyl alkohol dan asam klorida p.a.
Luria Bertani (LB) Cair : Ditimbang 10 g peptone, 5 g yeast ekstrak, dan
10 g NaCl campur dilarutkan dalam 800 mL air suling kemudian diukur pH
nya hingga 7 lalu ditambahkan akuades hingga 1 L dan dibagikan ke dalam
tabung masing-masing 5 mL, selanjutnya disterilkan dengan autoclave
selama 20 menit pada suhu 121°C.
LB Ampicillin Cair : Dibuat larutan natrium ampisilin 1mg/µl dalam
akuades steril yaitu 1000 mg natrium ampisilin dilarutkan dalam 1000 µl
akuadest steril kocok dan larutkan, kemudian diambil 100 µl larutan
ampisillin dan diencerkan pada labu ukur 100 mL hingga tanda batas, lalu
disimpan dalam aliquot-aliquot pada suhu -20ºC. Untuk medium dasar
dibuat dengan konsentrasi akhir 35-50µg/ml dengan cara : diambil 200 µl
kemudian masukkan kedalam 5 mL media luria bertani cair.
39
Reagen Kit : Kit yang digunakan dalam penelitian adalah Mini Plasmid Kit
Presto TM (Geneaid) untuk isolasi plasmid. Komponen-komponen kit terdiri
dari PD1 buffer mengandung Tris,EDTA,glukosa, dan RNase A, PD2 buffer
mengandung NaOH dan detergen SDS (Sodium Dodesil Sulfat), PD3 buffer
mengandung Kalium Asetat, true blue lysis buffer, w1 buffer, wash buffer
(add ethanol), elution buffer, R-Nase A (50mg/ml), PDH columns, 2 mL
collection tubes.
Buffer TBE 10X : Sebanyak 108 g Tris base, 55 g asam borat, 40 ml EDTA
0,5 M, (pH 8,0) dilarutkan dalam akuades hingga volume tepat 1000 mL
untuk menghasilkan larutan stock buffer TBE 10x.
Buffer TBE 1x : Buffer TBE 1x dibuat dengan mencampurkan 50 mL
buffer TBE 10x dan akuabides hingga volume tepat 500 mL.
Gel Agarosa 1% : Sebanyak 0,5 gram agarosa powder dilarutkan dalam
50 mL buffer TBE 1x dalam Erlenmeyer, didihkan sampai larut dalam
microwave selama 4 menit, dinginkan sampai suhu 60°C dalam suhu
kamar, kemudian tambahkan 10 µL etidium bromide (Syber Safe) dan
dikocok hingga merata. Tuang kedalam tray yang sebelumnya telah
dipasang sisir (comb).
2. Pengambilan Sampel
Sampel diperoleh dari urin aliran tengah stream urin (clean voided
midstream urin). Urin dikeluarkan langsung dan ditampung ke dalam
botol steril, urin yang pertama-tama keluar tidak ikut serta ditampung
(Washington et al., 1997).
40
3. Isolasi dan Identifikasi isolat Escherichia coli
Isolasi dan identifikasi isolat E. coli dilakukan selama 3(tiga) hari melalui
tahapan sebagai berikut : (Soemarno, 2000; Washington et al., 1997; Frankel
et al., 1970).
Hari pertama spesimen urin tanam dengan menggunakan ose standar yang
bervolume (10-3), kemudian goreskan secara zig-zag tiga kuadran pada media
Nutrien agar plate dan MC agar, lalu diinkubasi 37°C selama 18-24 jam. Hari
kedua dilakukan hitung jumlah koloni yaitu jika didapatkan bakteri kurang
dari 10000 per ml urin dilaporkan kemungkinan tidak ada ISK, jika jumlah
bakteri 10000-100000 per ml urin maka pemeriksaan hitung kuman diulangi
dan jika jumlah bakteri lebih dari 100000 per ml urin, dilaporkan
kemungkinan adanya ISK, kemudian dilakukan pengecatan Gram dan
pembacaan terhadap hasil pertumbuhan pada media Nutrien agar dan Mac
conkey agar, bila terdapat koloni dengan ciri-ciri koloni yaitu ukuran sedang,
warna merah, smooth, cembung dan memfermentasi laktosa maka koloni
tersebut kemudian dipilih untuk dilakukan uji biokimia dengan ditanam secara
gores ke media agar miring yaitu TSIA, SC, dan Urea, kemudian ditanam
dengan cara tusuk ke medium SIM dan diinkubasi 37° C selama 24 jam. Hari
ketiga dilakukan pembacaan hasil uji biokimia TSIA, SC, SIM, dan Urea.
Perubahan yang terjadi diamati dan dicatat, hasil yang diperoleh dicocokkan
pada tabel biokimia untuk E. coli (Tabel 1). Hasil yang sesuai dilanjutkan
pada uji resistensi (Washington et al., 1997; Frankel et al., 1970).
41
4. Uji Resistensi Isolat Escherichia coli
Uji resistensi isolat E. coli terhadap antibiotik yang berbeda menggunakan
metode cakram (Disc Difusion) Kirby-Bauer (Bauer et al., 1996) dengan
kekeruhan standar Mac Farlan 0.5 melalui tahapan sebagai berikut :
a. Sebanyak 2 (dua) ose bakteri uji disuspensikan dalam NaCl fisiologis steril
dalam tabung reaksi dan dihomogenkan dengan vortex, sehingga
kekeruhannya sama dengan kekeruhan standar Mac Farlan 0.5.
b. Ambil lidi kapas steril kemudian celupkan kedalam suspensi kuman dan
diputar beberapa kali kemudian ditekan-tekan pada dinding tabung untuk
membuang kelebihan inokulum, lalu lidi kapas steril dihapuskan secara
merata pada permukaan MH Agar. Cawan petri ditutup dan biarkan cawan
tersebut 3-5 menit.
c. Disk antibiotik ditaruh hati-hati di atas biakan bakteri tersebut dan
ditekan perlahan dengan pinset steril supaya benar-benar kontak dengan
yang terdapat pada media. Jarak disk dengan tepi cawan petri 15 mm dan
jarak antar disk 24 mm. Biakan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 16-18
jam.
d. Karakterisasi dengan mengukur diameter zona hambatan yang berwarna
jernih disekitar disk dan membandingkan diameter daerah hambatannya
terhadap standar dari National Commite of Clinical Laboratory standart
(Tabel 2) (CLSI, 2012). Sensitif (S), Intermediate (I), dan resisten (R)
terhadap antibiotik disimpulkan berdasarkan diameter zona hambatan
yang berwarna jernih di sekitar disk antibiotik. Pengukuran dilakukan dua
kali (duplo).
42
5. Penyimpanan Isolat Bakteri
Isolat bakteri yang telah dilakukan uji resistensi disimpan dalam kultur stok gliserol
(Sambrook et al., 1989). Adapun penyimpanan dilakukan dengan cara, yaitu koloni
yang dipilih dari media MH agar dikultur pada media Luria bertani cair yang
mengandung ampisilin sebanyak 500 µL dalam sample cup eppendorf steril kemudian
diinkubasi pada 37ºC selama 12 jam. Setelah 12 jam ditambahkan gliserol 40%
sebanyak 500 µL, dihomogenkan dan disimpan di freezer -20°C, jika akan dilakukan
isolasi plasmid, kultur stok dikeluarkan di suhu kulkas terlebih dahulu, kemudian
biarkan mencair di suhu ruang.
6. Persiapan Isolasi Plasmid
Kultivasi pada media Luria bertani cair dilakukan dengan cara : diambil 50 µL
suspensi bakteri dari kultur stok dengan mikropipet, masukan dalam Luria
bertani cair 5 mL dalam tabung reaksi yang mengandung ampicillin,
kemudian diinkubasi pada shaker orbital incubator 37oC selama 16 jam
(Overnight). Suspensi bakteri siap dilakukan isolasi DNA plasmid.
7. Isolasi Plasmid
Isolasi plasmid bakteri menggunakan PrestoTM Mini Plasmid Kit dari Geneaid.
Tahapan kerja kit tersebut menggunakan prinsip metode alkaline lysis solution
(Sambrook et al., 1989). Isolasi plasmid diawali dengan kultivasi bakteri pada
media Luria bertani cair 5 mL dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 16 jam.
43
Proses isolasi dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :
a. Pemanenan
Sebanyak 1,5 mL kultur bakteri dalam Luria bertani cair dipindahkan
kedalam tabung mikrosentrifuga dan disentrifugasi dengan kecepatan
14.000 x g selama 1 menit pada suhu kamar untuk membentuk pelet sel.
Supernatan mengandung medium dibuang. Tambahkan lagi kultur sel
bakteri dan sentrifugasi kembali 14.000 x g selama 1menit, ulangi hingga
kultur habis.
b. Resuspensi Sel
Pelet yang terbentuk diresuspensi dengan 200 µl PD1 buffer ke dalam
tabung mikrosentrifuga yang baru dan ditambah 2 µl true blue lisis buffer
ke tabung tersebut, kemudian divortex hingga larut.
c. Pemecahan sel
Larutan yang telah diresuspensi ditambah 200 µl PD2 buffer kemudian
campur dengan dibolak-balik 4-6 kali (jangan di vortex). Diamkan selama
2-5 menit pada suhu kamar untuk membentuk lisat yang homogen.
Pencampuran sempurna jika semua suspensi berwarna biru.
d. Netralisasi
Campuran tersebut ditambahkan 300 µl PD3 buffer lalu dibolak-balik
cepat 4-6 kali (jangan divortex) dan disentrifugasi 14.000 x g selama 3
menit di suhu kamar. Setelah menambahkan PD3 buffer, suspensi menjadi
tidak berwarna.
44
e. Pengikatan DNA
Semua supernatan dipindah ke coloumn spin dan disentrifugasi 14.000 x g
selama 30 detik pada suhu kamar lalu larutan pada tabung mikrosentrifuga
dibuang kemudian letakkan kembali coloumn spin ke tabung
mikrosentrifuga.
f. Pencucian
Tambahkan 400 µL W1 buffer kedalam coloumn spin dan disentrifugasi
14.000 x g selama 30 detik, larutan dalam tabung mikrosentrifuga dibuang
kemudian letakkan kembali column spin ke tabung mikrosentrifuga dan
disentrifugasi kembali 14.000 x g selama 30 detik untuk menghilangkan
residu wash solution.
g. Proses Elusi
Pindahkan coloumn spin kedalam tabung mikrosentrifuga baru kemudian
ditambah 50 µl Elusion buffer, diamkan 2 menit dan disentrifugasi 14.000
x g selama 2 menit pada suhu kamar. Hasil isolasi DNA plasmid diperiksa
dengan teknik elektroforesis gel agarosa 1%.
8.
Elektroforesis Gel Agarosa
Hasil isolasi plasmid dielektroforesis menggunakan gel agarosa dengan
konsentrasi 1% (Sambrook and Russel, 2001). Gel agarosa 1% dibuat dengan
mencampur 0,5 g bubuk agarosa dengan 50 ml larutan TBE 1x. Campuran
bubuk agarosa dan buffer TBE 1x kemudian dihomogenkan dan dipanaskan
di atas microwave sampai larutan gel berwarna bening, dinginkan larutan
pada suhu kamar dan tambahkan etidium bromida (Syber safe)10 µL.
45
Larutan gel dituang dalam cetakan yang sudah disiapkan. Sisir (cetakan
sumur) dipasang dengan posisi tegak dan tidak sampai pada permukaan
cetakan gelas (3-5 cm dari permukaan gelas). Gel dibiarkan mengeras (15-45
menit), sisir diangkat setelah gel mengeras, kemudian gel diletakan di dalam
aparatus elektroforesis dan direndam dengan larutan TBE 1x. Sampel hasil
isolasi plasmid (Eluen) sebanyak 10 µL dicampur dengan loading dye
sebanyak 2 µL. Proses pencampuran dilakukan diatas parafilm dan dilakukan
dengan cara pipeting. Campuran dimasukan masing-masing ke dalam sumur
pada gel. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan tegangan listrik
sebesar 100 volt selama ± 45 menit. Pita DNA divisualisasi dengan UV
transiluminator, kemudian hasil elektroforesis didokumentasikan
menggunakan kamera digital.
D. Analisis Hasil
1 . Analisis Univariat
Hasil penelitian disajikan secara kualitatif (deskriptif), ditampilkan
persentase isolat E.coli yang sensitive, intermediate, dan resisten terhadap
ampisilin, amikasin, trimethoprim, cefotaxime,ceftriaxone, cefixime,
aztreonam dan siprofloxacin dan hasil pola elektroforesis dengan melihat
pita-pita plasmid dibandingkan dengan pola elektroforesis pita plasmid
standar (marker).
46
2. Analisis Bivariat
Analisis bivariat digunakan untuk mencari korelasi pola resistensi antibiotik
dengan adanya plasmid. Dalam penelitian ini digunakan uji statistik TIndependent (T-test).
47
E. Diagram Alir Penelitian
Sampel Urine
Isolasi bakteri
E.coli
E. coli
Bakteri lain
Sensitif
Uji
Resistensi
Resisten
Isolat Sensitif Ampisilin disimpan dalam
stok gliserol tanpa Ampisilin
Isolat Resisten disimpan dalam stok
gliserol Ampisilin
Isolasi
Plasmid
Elektroforesis
Data
Analisis Data
Kesimpulan
Gambar 4. Diagram alir penelitian