Tugas II. Fraksionasi sel dan Struktur Protein

Tugas II. Fraksionasi sel dan Struktur Protein
II.1 Fraksionasi Sel dan Identifikasi Lokasi Seluler Aktifitas Katalase di Sel Hati Ayam
Pendahuluan
Revolusi studi biologi sel tiga perempat abad yang lalu tidak terlepas dari penemuan
sejumlah peralatan dan teknik eksperimen penting antara lain mikroskop elektron, teknik
penjejak/probing, dan fraksionasi sel. Teknik fraksionasi memungkinkan dilakukannya
pemisahan kompartemen dan komponen makromolekul sel sekaligus melakukan observasi
fisik dan analisis fungsi tiap bagian tersebut dengan resolusi yang lebih baik.
Hati merupakan salah satu organ vital pada hewan. Organ ini berperan dalam berbagai jalur
metabolisme sel, dan merupakan salah satu organ dengan kelimpahan protein dan enzim yang
tinggi. Salah satu enzim yang terdapat di hati adalah katalase, yang dikenal luas untuk fungsi
proteksi sel terhadap produk reaksi oksigen reaktif. Enzim ini terdapat pada hampir semua sel
hewan, namun konsentrasi tertinggi terdapat di hati.
Pada percobaan kali ini peserta diminta melakukan teknik fraksionasi sederhana dari sampel
sel hati hewan, untuk memisahkan komponen “sitosol” dan “organel sel”, dan selanjutnya
dilakukan uji katalase pada sampel hasil fraksionasi.
Alat dan Bahan:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Potongan sampel hati ayam dalam mikrotube
Pastel untuk homogenisasi
1 mL larutan sukrosa 10% @ 1 mikrotube
Mikrosentrifuga  di meja asisten
Mikrotube kosong @ 6 (untuk praktikum II.1 dan II.2)
1 mL Reagen H2O2 30% @ 1 mikrotube (anda boleh membuka selubung aluminium
foil)
7. Kaca objek @ 2 (untuk praktikum II.1 dan II.2)
8. Tissue (untuk praktikum II.1 dan II.2)
9. Plastik sampah (untuk praktikum II.1 dan II.2)
10. Tips biru @ 10, tips kuning @ 6, tips putih @ 3 (untuk praktikum II.1 dan II.2)
11. Pulpen marker (untuk praktikum II.1 dan II.2)
12. Sarung tangan (dibagikan saat perkenalan alat)
13. Mikropipet 1000, 100, 10 @ 1 (untuk praktikum II.1 dan II.2)
Petunjuk dan Aturan:
-
Gunakan alat dan bahan secara efektif. Praktikan diberi petunjuk langkah kerja namun
manajemen penggunaan tiap alat dan bahan (misal : reagen) yang disediakan
praktikan sendiri yang mengaturnya. Tidak ada penambahan alat dan bahan.
-
-
-
-
-
Bekerjalah dengan bersih dan rapi, buang sampah tips, mikrotube pada plastik sampah
yang telah disediakan. Di akhir percobaan tiap sesi, letakkan kembali alat dan bahan
yang anda gunakan secara rapi. Praktikan yang melakukan pengotoran pada meja
praktikum akan dikenakan sanksi pengurangan nilai praktikum Biologi Sel dan
Molekuler sebesar 20 poin
H2O2 30% adalah reagen yang berbahaya, anda wajib menggunakan sarung tangan
selama bekerja. Hindari cipratan ke kulit atau mata. Jangan sampai terminum,
tertelan, atau sengaja dihirup. Praktikan yang tidak menggunakan sarung tangan
selama pengerjaan tes, nilai praktikum biologi sel dan molekulernya adalah 0
Asisten akan mengingatkan anda waktu dinyalakannya alat sentrifuga. Segera
serahkan sampel ke asisten di meja sentrifuga sebelum waktu pengumpulan ditutup.
Di luar waktu yang ditentukan, peserta tidak bisa menggunakan alat tersebut.
Pulpen marker, gabus tempat tabung, gabus apung dan pinset ditinggalkan di meja.
Peserta yang membawa atau menghilangkannya dikenakan sanksi pengurangan
nilai praktikum Biologi Sel dan Molekuler sebesar 20 poin.
Asisten akan memberitahukan anda letak peralatan yang dipakai kolektif seperti
sentrifuga dan penangas air
Langkah Kerja:
1. Gunakan terlebih dahulu sarung tangan anda
2. Tambahkan 700 µL larutan sukrosa 10% ke dalam sampel potongan hati di
mikrotube. Tulis no kode meja anda dengan marker dibagian atas mikrotube.
Asisten akan menyerahkan sampel hasil sentrifuga berdasarkan no kode meja
3. Lakukan homogenasi dengan menggunakan pastel hingga sampel halus. Serahkan
sampel anda pada asisten yang ada di meja mikrosentrifuga. Sampel akan
disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. INGAT, pada menit ke 10
dimulainya tes, asisten akan menjalankan mikrosentrifuga, sebaiknya anda
menyerahkan sampel, sebelum waktu tersebut. Asisten akan mengingatkan anda
secara berkala
4. Hasil sentrifugasi akan diberikan asisten ke meja anda, sambil menunggu anda bisa
mengerjakan soal part II.1
5. Pindahkan 600 µL supernatan ke tabung mikrotube baru. Serahkan sampel anda pada
asisten di meja mikrosentrifuga. Sampel akan disentrifugasi pada kecepatan 14000
rpm selama 2 menit. INGAT, pada menit ke 4 setelah penyerahan hasil
sentrifugasi asisten akan menjalankan mikrosentrifuga. sebaiknya anda
menyerahkan sampel, sebelum waktu tersebut. Asisten akan mengingatkan anda
secara berkala
6. Hasil sentrifugasi akan diberikan ke meja anda, sambil menunggu anda bisa
mengerjakan soal tugas II.1
7. Pindahkan @ 100 µL supernatan ke 4 mikrotube baru. Tulis no peserta OSN
anda dengan marker dibagian atas mikrotube. Simpan sampel tube ini karena
akan anda gunakan untuk pengerjaan praktikum II.2
8. Ambil 10 µL supernatan yang tersisa, tuangkan ke kaca objek, tambahkan 10 µL
reagen H2O2. Amati hasil yang muncul
9. Buang supernatan yang tersisa ke plastik sampah, keringkan pelet sel dengan tisu.
Tambahkan 20 µL reagen H2O2 pada pelet di tube. Amati hasil yang muncul
SOAL TUGAS II.1
1. (Nilai 1) Apa fungsi penambahan larutan sukrosa 10%. Beri tanda “X” pada kotak
jawaban
A.
B.
C.
D.
E.
Buffer hipotonis
Buffer isotonis
Buffer hipertonis
Buffer amphipatic
Lisis sel
A
B
C
D
E
X
2. (Nilai 1) Sentrifugasi homogenat pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit
dilakukan untuk memisahkan? Isi kolom supernatan dan pelet dengan pilihan
jawaban yang benar (tulis A-E, jawaban bisa lebih dari satu).
Pilihan jawaban:
A. Debris sel
B. Nukleus
C. Organel
D. Sitosol
Supernatan
Pelet
B,C,D
A
3. (Nilai 1) Sentrifugasi homogenat pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit
dilakukan untuk memisahkan. Isi kolom supernatan dan pelet dengan pilihan
jawaban yang benar (tulis A-E, jawaban bisa lebih dari satu).
Pilihan jawaban:
E. Debris sel
F. Nukleus
G. Organel
H. Sitosol
Supernatan
Pelet
H
F,G
4.
(Nilai 8) Tentukanlah lokasi aktivitas intraseluler dari enzim katalase berdasarkan
metode fraksionasi sel sederhana yang anda lakukan. Beri tanda “X” pada
jawaban anda (Jawaban bisa lebih dari satu)
Sitosol
Organel
X
X
5. (Nilai 1) Berdasarkan hasil identifikasi lokasi aktivitas katalase dan keterangan
pada modul, tentukan manakah diantara pilihan sel/organisme di bawah ini yang
mungkin memiliki aktifitas katalase. Beri tanda “X” pada jawaban anda
A. Sel darah merah
B. Clostridium botulinum
C. Sel otot
D. Chlamydomonas reinhartdii
A
X
B
C
D
X
X
II. 2. Protein Folding and Solubility (Pelipatan dan Kelarutan Protein)
Pendahuluan
Pelipatan protein merupakan proses vital bagi keberlangsungan fungsi suatu protein. Proses
ini ditentukan oleh banyak faktor seperti, kondisi fisik dan kimia sel, intensitas ekspresi,
lokasi dan pengaruh protein lain dalam sistem pengontrolan kualitas protein. Kesalahan
pelipatan protein salah satunya dapat terjadi karena pengaruh suhu lingkungan. Suhu tinggi
menyebabkan protein menjadi tidak terlarut. Hal ini dikarenakan perubahan posisi residu dan
terbentuknya ikatan baru yang sulit terjadi pada suhu yang lebih rendah. Contoh yang paling
umum adalah pada pemanasan protein putih telur. Gumpalan protein hasil pemanasan tidak
dapat dilarutkan kembali dengan pengenceran biasa. Akan tetapi terdapa beberapa larutan
kimia yang dapat membantu proses pelarutan protein hasil pemanasan dengan
“merelaksasikan” kembali konformasi protein yang salah melipat.
Pada tes II.2 anda diminta menentukan dua kombinasi larutan berbeda yang dapat
membantu proses pelarutan protein hasil pemanasan
Alat dan Bahan
1. Empat mikrotube sampel supernatan homogenat hati @ 100 µL yang disiapkan dari
praktikum II.1
2. Penangas air (suhu 100oC di meja asisten)
3. Lima larutan untuk uji pelarutan protein, masing-masing dalam satu mikrotube:
- 500 µL larutan HCl 1 M
- 500 µL larutan SDS 10%
- 500 µL larutan NaOH 1 M
- 500 µL larutan NaCl 1 M
- 20 µL larutan β-Mercaptoetanol
4. Pinset
5. Gabus apung 4 slot
6. timer
Petunjuk dan Aturan:
-
-
Berhati-hati bekerja dengan HCl 1 M, NaOH 1 M, SDS 10%, dan βMercaptoetanol. Hindari cipratan ke kulit dan mata. Jangan dihirup secara
sengaja. Jangan terlalu dekat posisi reagen dengan muka
Timer ditinggalkan di meja setelah praktikum selesai
Langkah kerja:
1) Letakkan 4 tube sampel anda yang telah diberi label di bagian tutup mikrotube ke
dalam gabus apung. bawa sampel anda ke pengangas air mendidih yang ada di meja
2)
3)
4)
5)
6)
asisten dan inkubasi sampel pada air mendidih selama 5 menit. Sambil menunggu
anda bisa menjawab soal II.2
Setelah 5 menit ambil sampel anda dari air mendidih dengan menggunakan pinset.
Sampel protein anda sekarang menjadi rusak dan tidak terlarut (akibat terjadinya
kesalahan pelipatan protein). Tunjukkan sampel anda pada asisten, dan asisten akan
memberi label sebagai tanda telah selesai melakukan proses pemanasan protein (Nilai
3 @ 0.75). Anda tidak dapat melakukan proses pemanasan protein lagi setelah ini.
Sampel yang tidak membentuk gumpalan setelah pemanasan tidak dapat digunakan
untuk uji.
Anda disediakan 5 larutan yang berbeda untuk uji pelarutan protein, yaitu larutan
HCl, SDS, NaOH, NaCl, dan β-mercaptoethanol. Anda secara bebas dapat melakukan
uji pelarutan protein dari empat sampel yang telah disiapkan. Uji dilakukan dengan
melakukan kombinasi masing-masing 100 µL larutan HCl, SDS, NaOH, NaCl dan 10
µL β-mercaptoethanol ke dalam 100 µL sampel hasil pemanasan. Total volume
larutan yang anda tambahkan ke sampel adalah 200 µL atau 110 µL
Lakukan resuspensi untuk mencampur sampel protein dan larutan uji
Karena sampel yang anda miliki terbatas, maka rancanglah percobaan anda terlebih
dahulu dengan cermat. Catat rancangan percobaan anda dan hasilnya pada Tabel
Catatan percobaan (Nilai 10)
Jawablah pertanyaan di soal II. 2 (Nilai 6) dan soal tambahan pada LEMBAR
CATATAN PERCOBAAN
SOAL TUGAS II.2
1. (Nilai 2 ; @0.5) Grafik di bawah ini menunjukkan termodinamika dari pelipatan suatu
protein
Keterangan: ΔGŧ = perubahan energi bebas aktivasi, ΔG = perubahan energi bebas
Berdasarkan grafik di atas tentukanlah mana pernyataan di bawah ini yang Benar (B)
atau Salah (S):
No
1
2
3
4
Jawaban (B/S)
Pernyataan
Pelipatan protein normal merupakan reaksi eksotermik
Energi aktivasi pembentukan polimer protein misfolded
lebih rendah daripada energi aktivasi pembentukan
protein misfolded tunggal
Pembentukan protein yang salah melipat (misfolded)
merupakan reaksi endotermik
Protein awal yang belum melipat (folded) memiliki energi
bebas yang lebih tinggi daripada protein yang telah
melipat
B
B
S
B
2. (Nilai 2) Manakah diantara diagram struktur protein di bawah ini yang paling tepat
menunjukkan konformasi protein yang mengalami salah melipat (misfolding) setelah
pemanasan. Beri tanda “X” pada jawaban anda
A
B
C
D
X
3. (Nilai 2 ; @ 0.5) Perhatikan diagram perubahan energi bebas aktivasi protein di
bawah ini
Berdasarkan grafik tersebut, prediksilah mana pernyataan di bawah ini yang Benar
(B) atau Salah (S)
No
1
2
3
4
Jawaban (B/S)
Pernyataan
Terdapat penyakit herediter yang terkait perilaku
pelipatan protein seluler
Konsentrasi protein yang diproduksi tidak mempengaruhi
proses pelipatan protein
Perubahan kondisi pH dapat mempengaruhi kecepatan
pembentukan protein yang salah melipat
Pada beberapa protein, modifikasi lingkungan seperti
penambahan senyawa tertentu hanya mempengaruhi
kecepatan pembentukan protein misfolded pada spesies
normal
B
S
B
S
LEMBAR CATATAN PERCOBAAN
Tabel catatan percobaan
Tube
Larutan Uji
Volume
larutan uji
(µL)
Hasil
Pengamatan
1
2
3
4
Isi Tabel dengan:
1) Kode kolom “Larutan Uji” :
- Larutan HCl 1 M: HCl
- Larutan SDS 10%: SDS
- Larutan NaOH 1 M: NAOH
- Larutan NaCl 1 M: NACl
- Larutan β-Mercaptoetanol: MERK
2) Kolom “Volume larutan uji”: tulis dengan angka
3) Kolom “Hasil Pengamatan”:
Larut: L
Tidak Larut: TL
Berdasarkan percobaan yang anda lakukan, tentukan/prediksilah kombinasi larutan yang
dapat melarutkan kembali protein hasil pemanasan (Nilai 8)
Larutan 1
Larutan 2
Larutan Uji
SDS
MERK
(Jawab dengan kode larutan seperti di tabel catatan percobaan)
Jika suatu protein dari sampel hati mengalami inaktivasi setelah proses pemanasan, apakah
aktivitasnya akan dapat diamati kembali setelah proses pelarutan yang anda lakukan seperti
percobaan di atas. Beri tanda”X” pada jawaban anda (Nilai 4)
Ya
Tidak
X
ORET-ORET BUAT IHSAN:
B
A
p
i
p
p
i
n
n
n
p
n
n
n
p
p
n
n
n
p
C
n
n
n
D
n
p
p
p
i i
p
p
i
p
p n
p
n
n p
i
n
i
p