Enzim endonuklease restriksi tipe II

Enzim Pemotong Asam Nukleat
DNAase :
RNAase:
enzim yg dapat memotong DNA
enzim yg dapat memotong RNA
DNAase ada yang hanya memotong DNA untai tunggal,
ada yg hanya memotong untai ganda
DNAase dibagi menjadi 2:
Endonuklease
: memotong dari bag dalam DNA
Eksonuklease
: memotong dari bag luar
Enzim Endonuklease Restriksi
Ditemukan tahun 1962 di dalam bakteri
Bakteri E. coli memiliki sistem kekebalan enzimatik
yang dapat mengenal dan menghancurkan DNA asing
3,000 telah diidentifikasi, ratusan telah dikomersialkan
Enzim Endonuklease Restriksi:
Enzim endonuklease yang bersifat khusus, yaitu
hanya memotong DNA untai ganda yang
mempunyai urutan nukleotida tertentu.
Ada tiga tipe :
Enzim endonuklease tipe I, tipe II,dan tipe III
Enzim Endonuklease Tipe I
Enzim ini mempunyai aktivitas
endonuklease sekaligus
metilase dan memerlukan ATP,
Mg2+, dan S-adenosil metionin
sebagai kofaktor.
Selain itu, enzim endonuklease
restriksi tipe I juga mempunyai
aktivitas ATPase.
Enzim Endonuklease Tipe I
Enzim ini mengenali urutan nukleotida tertentu
(recognition site) yang berupa urutan pasangan
basa sebagai berikut:
EcoK, mengenali urutan 5’AACNNNNNNGTGC-3’,
EcoB mengenali urutan 5’-TGANNNNNNNNTGCT-3’.
Huruf N menyatakan basa nukleotida apa saja
(tidak spesifik).
Enzim Endonuklease Tipe I
Meskipun enzim ini secara spesifik mengenali
daerah tertentu, tetapi enzim ini memotong DNA
pada daerah yang berlainan dengan daerah
pengenalannya sehingga pemotongannya tidak
spesifik. Dalam aplikasinya untuk rekayasa
genetik, enzim endonuklease restriksi tipe I ini
tidak banyak dipergunakan
Endonuklease restriksi tipe II
Endonuklease restriksi tipe II
mempunyai perbedaan mendasar dengan
tipe I karena enzim tipe II mempunyai
spesifitas. Daerah yang dikenali maupun
daerah yang dipotong enzim tersebut
bersifat spesifik dan terletak pada bagian
yang sama.
Endonuklease restriksi tipe II
Enzim ini sangat stabil dan hanya memerlukan
Mg2+ sebagai kofaktor. Enzim endonuklease
restriksi tipe II dapat dibedakan atas urutan
nukleotida yang dikenali yang dapat berupa
urutan empat, lima, atau enam basa spesifik.
Sampai saat ini telah ratusan macam enzim tipe
II yang berhasil diisolasi dari bermacam-macam
bakteri.
Daerah pengenalan
endonuklease restriksi tipe II
Contohnya enzim EcoRI yang diisolasi dari
bakteri Escherichia coli RY13 mempunyai
daerah pengenalan dan pemotongan DNA
berupa urutan 5’-GAATTC-3’. Jika basa
nukleotida komplemen urutan tersebut
dibaca dari ujung 5’ maka juga akan
memberika urutan yang sama sebagai
berikut:
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
Hasil pemotongan EcoRI:
ujung kohesif= ujung lekat
Urutan basa nuklleotida semacam itu disebut
urutan palindrome. Enzim EcoRI secara spesifik
memotong ikatan antara G dan A sehingga hasil
pemotongannya menghasilkan molekul DNA
dengan ujung yang tidak sama panjang dan sering
disebut ujung kohesif atau ujung lekat (cohesive
end atau sticky end) sebagai berikut:
5’-G
3’-CTTAA
AATTC-3’
G-5’
Kerja Enzim restriksi EcoR1
Sticky ends and blunt ends
Ujung lancip dan ujung tumpul
Enzim mengenal urutan spesifik 4-8 bp
Beberpa enzim memotong dg pola - “sticky ends”
EcoRI
5’…GAATTC…3’
3’…CTTAAG…5’
Beberpa enzim memotong dg pola – “blunt ends”
PvuII
5’…CAGCTG…3’
3’…GTCGAC…5’
Penggunaan dalam rekayasa genetik
Human DNA cleaved with EcoRI
5’-C-G-G-T-A-C-T-A-OH
3’-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-PO4
Corn DNA cleaved with EcoRI
+
PO4-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
HO-T-C-G-A-T-G-C-5’
Complementary base pairing
5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G T-C-G-A-T-G-C-5’
+ DNA Ligase, + ATP
5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-T-C-G-A-T-G-C-5’
recombinant DNA molecule
Ujung lekat dapat disambung
dengan mudah dengan enzim
DNA ligase
Kedua ujung hasil pemotongan
tersebut akan dengan mudah
disambung lagi dengan menggunakan
enzim DNA ligase, oleh karena itu
ujung-ujungnya sering disebut ujung
kohesif.
Endonuklease restriksi tipe II
Enzim AluI
Enzim ini mengenali urutan 5’AGCT-3’ dan memotong DNA
tersebut menjadi molekul dengan
ujung tumpul ( blunt end), karena
memotong ikatan antara G dan C
Enzim endonuklease restriksi tipe II
merupakan kelompok enzim yang paling
banyak digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan (rekayasa genetik) untuk
memotong DNA secara spesifik.
Endonuklease restriksi tipe III
Endonuklease restriksi tipe III juga
memotong DNA pada bagian yang
spesifik tetapi pada daerah yang
berdekatan dengan daerah
pengenalannya. Enzim ini juga
memerlukan ATP dan Mg2+ untuk
aktivitasnya, tetapi tidak mempunyai
aktivitas ATPase serta tidak
memerlukan S-adenosil metionin
seperti enzim endonuklease restriksi
tipe I.
Endonuklease restriksi tipe III
Salah satu contoh enzim endonuklease
restriksi tipe III adalah enzim HgaI yang
mengenali urutan urutan basa
nukleotida 5’-GACGC-3’, tetapi
memotong DNA pada urutan basa
kelima atau kesepuluh dari urutan yang
dikenali tersebut. Enzim tipe ini sangat
jarang digunakan dalm teknologi DNA
rekombinan.
Tata Nama Enzim endonuklease
restriksi
Sejak penemuannya pada 1970an, lebih
dari 100 jenis enzim endonuklease
restriksi tipe II telah diidentifikasi di
dalam bakteri yang berbeda. Setiap enzim
dinamai dari mana bakteri itu diisolasi
menggunakan sistem penamaan yang
didasarkan genus bakterial, spesies, dan
strain. Sebagai contoh, nama enzim
restriksi EcoRI diturunkan sbb;
Tata Nama
Singkatan
Arti
E
Escherichia
genus
Co
coli
spesies
R
RY13
strain
I
diidentifikasi pertama
Deskripsi
urutan identifikasi di dalam bakteri tersebut
PLASMID
Pada beberapa jasad, terutama
pada kelompok prokariot,
seringkali dijumpai bahan genetik
tambahan selain bahan genetik
utama yang ada dalam kromosom
. Bahan genetik tambahan/ekstra
semacam ini secara umum
disebut plasmid
PLASMID
Plasmid pada prokariot berupa molekul
DNA untai ganda dengan struktur lingkar
(circular). Pada umumnya plasmid tidak
dibutuhkan oleh sel untuk pertumbuhan
meskipun seringkali plasmid membawa
gen-gen tertentu yang memberikan
keuntungan tambahan bagi sel dalam
keadaan tertentu, misalnya gen
ketahanan terhadap antibiotik, ketahanan
terhadap logam berat, dsb.
Plasmid dapat dihilangkan tanpa
mengganggu pertumbuhan
Dalam keadaan normal plasmid
dapat dihilangkan dengan
metode kuring tanpa
mengganggu perumbuhan
selnya.
Plasmid ada dimana ?
Plasmid berada bebas di dalam
sitoplasma dan pada umumnya
bereplikasi secara independen (tidak
tergantung DNA inti sel).
Berapa Jumlah Copy Plasmid ?
Jumlah turunan (copy number)
plasmid di dalam suatu sel
bervariasi dari satu copy sampai
beberapa ratus kopi. plasmid seri
pUC, dapat diperbanyak jumlahnya
di dalam E.coli sehingga dapat
mencapai jumlah turunan sampai
lebih dari seribu copy per sel.
Ukuran Plasmid
Ukuran plasmid
sangat bervariasi
tetapi pada
umumnya lebih kecil
dari ukuran bahan
genetik utama
(kromosom) sel
prokariot.
PLASMID:
ada yg alami, ada pula yg artifisial
Alami
Pada dasarnya plasmid
merupakan entitas genetik
yang diketemukan secara
alami di dalam sel
beberapa kelompok
prokariot dan eukariot
PLASMID:
ada yg alami, ada pula yg artifisial
Artifisial
Dengan teknik rekayasa genetik,
sekarang telah dapat
dikembangkan plasmid artifisial
dengan cara menggabungkan
gen-gen dari beberapa plasmid
alami maupun dari genom jasad
tertentu. Salah satu contoh
plasmid artifisial adalah plasmid
seri pUC, misalnya pUC 18 dan
pUC 19 , dan juga plasmid
pBR322.
Plasmid pUC18/19
Plasmid pBR322 mengandung dua gen resitensi/
ketahanan terhadap:
1. antibiotik ampisislin , ampr
2. Antibiotik tetrasiklin, tetr
Artinya apabila suatu bakteri dalam sitoplasmanya
terdapat plasmid pBR322 ini maka bakteri itu akan bisa
bertahan hidup dalam media yang mengandung
ampisilin ataupun tetrasiklin.
Sedangkan bakteri yang tidak mengandung plasmid ini
maka akan mati jika berada di dalam media yg
mengandung antibiotik tersebut.
Dalam keadaan normal, kehadiran
plasmid pada umumnya tak
diperlukan oleh sel. Dalam keadaan
tertentu misalnya dalam media yg
mengandung antibiotik, maka
diperlukan plasmid oleh bakteri untuk
mempertahankan hidupnya dengan
menggunakan gen ketahanan
antibiotik yg ada dalam plasmid.
CONTOH PLASMID ARTIFISIAL
HASIL REKAYASA
Gambar Plasmid pBR322
Sifat plasmid pBR 322
• Relatif kecil dengan
berat molekul 2,6x106
• Telah diketahui uruturutan nukleotidanya
4362 secara komplit
• Mempunyai sisi
pemutus tunggal
untuk PstI, SalI,
EcoRI,HindIII,BamHI
• Mempunyai 2
penanda resistensi (
ampicillin dan
tetrasiklin)
Rekombinasi Plasmid dengan Gen
Asing (Gen yang disisipkan)
1. Plasmid dipotong dengan enzim
endonuklease restriksi tertentu
2. DNA Kromosom juga dipotong dengan
enzim endonuklease restriksi yang sama
3. Hasil potongan keduanya
disambungkan, maka akan diperoleh
plasmid rekombinan yaitu plasmid yang
telah tersisipi potongan DNA (gen) sel
donor
4. Plasmid rekombinan ditransformasikan
ke dalam sel inang, misalnya E. coli.
Bagian mana dari plasmid yg
dipotong?
Urutan DNA plasmid sudah tertentu sehingga
dapat dikenali dan dipotong dengan enzim
endonuklease tertentu . Misalnya plasmid
pBR322 akan terpotong oleh enzim PstI pada
daerah gen ketahanan terhadap
ampisilin(ampr). Pemotongan plasmid pada
daerah ini akan menyebabkan kerusakan gen
ketahanan terhadap ampisilin tersebut . Bakteri
yg membawa plasmid yg telah terpotong pada
gen ampr tidak lagi tahan dalam media yg
mengandung ampisilin
Rekombinasi Plasmid dengan Gen
Asing (Gen yang disisipkan)
Identifikasi Bakteri Pembawa Plasmid
Rekombinan
Seleksi dg Antibiotik
Sel 1 dan sel 2
tahan thd
tetrasiklin:
membawa
plasmid dg gen
tetr
Masih utuh
Sel 1 gen tetr dan gen
ampr utuh semuanya.
Sehingga tahan
ampisilin
Sel 2 gen tetr
utuh
tetapi gen ampr
telah rusak
sehingga tidak
tahan ampisilin
Transformasi Gen dengan Plasmid
pUC18/19
PLASMID pUC 18/19
Enzim Beta Galaktosidase
5-bromo- 4-dikloro-indolb_D-Galaktosidase
SOAL QUIZ 1
1. a) Definisikan “ Bioteknologi “
b) Apa yang membedakan Bioteknologi
konvensional dan Bioteknologi
modern/molekuler
Lanjutan Soal Quiz 1
2. Jika kloning gen ke dalam suatu bakteri
menggunakan plasmid pBR322. Baik
plasmid maupun DNA sumber gen donor
dipotong dg enzim PstI . Jelaskan
bagaimana cara membedakan bakteri yg
membawa plasmid rekombinan dan
bakteri yang membawa plasmid asli/ utuh.
3.
Dari transkripsi DNA berikut, anda diminta
menggambarkan urutan mRNA hasil transkripsi
yang berbentuk struktur batang dan lengkungan (loop)
sebagai pertanda transkripsi segera diakhiri
4.
Jelaskan kenapa enzim endonuklease
restriksi tipe 2 banyak digunakan untuk
memotong gen dalam bioteknologi
modern.
Berikan contohnya.