metode penelitian

sistem ini adalah didapatkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan tanpa
stacking gel dalam volume sampel yang sama (Ahmed 2005).
Deteksi protein dalam gel dilakukan dengan berbagai macam pewarnaan
seperti coomassie blue, silver nitrat, dan amido black (Ahmed 2005). Coomassie
blue merupakan pewarnaan yang cepat dan sering digunakan untuk visualisasi
protein pada gel poliakrilamid (Ahmed 2005; Bonner 2007). Protein dapat
terdeteksi oleh coomassie blue apabila konsentrasi sampel protein yang diloading
dalam gel sebelum tahapan rehidrasi sebanyak 500 µg sampai dengan 1 mg (Blot
2003). Dibandingkan dengan coomassie blue, pewarnaan silver nitrat jauh lebih
sensitif (Janson & Ryden 1998; Blot 2003) bahkan pada konsentrasi nanogram,
akan tetapi membutuhkan waktu lebih lama (Ahmed 2005).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari-Juli 2010 di Laboratorium
Embriologi dan Laboratorium Layanan Pendidikan Terpadu, Fakultas Kedokteran
Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain peralatan bedah steril,
pinset, mikropipet, tip, timbangan digital, biosafety cabinet, mikroskop, cawan
petri steril, object glass, cover glass, gelas piala, gelas ukur, tabung konikal,
tabung eppendorf, mikrofilter, spuit, hemositometer, dan mesin elektroforesis.
Bahan–bahan yang digunakan antara lain otak tikus (Rattus norvegicus)
umur 3 hari (newborn), medium kultur mDMEM (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium) yang dimodifikasi dengan penambahan asam amino non esensial
(AANE) 10%, fetal bovine serum (FBS) 10%, sodium bikarbonat 3 mM, 2mercaptoetanol 0,1 mM dan gentamisin 50 µg/ml, phosphate buffered saline yang
dimodifikasi dengan penambahan FBS 0,1% dan gentamisin 50 µg/ml (mPBS),
insulin transferrin selenium (ITS),
pewarna hematoksilin eosin, dan pewarna silver nitrat.
Metode
Isolasi Sel Saraf Otak Besar
Tikus strain SD (Sprague Dawley) umur 3 hari dimatikan terlebih dahulu
dengan menggunakan eter kemudian daerah kepala didesinfeksi dengan alkohol
70%. Otak bagian cerebrum diisolasi dan dicuci dengan larutan PBS. Suspensi
otak dibuat dengan cara menyedot dan mengeluarkan kembali secara berulang
menggunakan spuit 1 cc yang mengandung larutan mPBS. Suspensi dimasukkan
ke dalam tabung dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 210 g selama 10
menit. Pencucian dilakukan dengan mPBS sebanyak 4 kali ulangan dan medium
mDMEM sebanyak 1 kali ulangan. Terakhir pelet diresuspensi dalam larutan
mDMEM sebanyak 1 ml.
Kultur Sel Saraf Otak
Suspensi otak dengan konsentrasi 104 sel/ml dikultur dalam 3 cawan petri
yang telah dilapisi dengan gelatin 0,1% dan berisi 2 ml mDMEM dengan dan
tanpa ITS. Kultur sel otak dilakukan dengan teknik aseptis di dalam clean bench
untuk mencegah kontaminasi. Kultur diinkubasi dalam inkubator CO 2 5% pada
suhu 37°C. Penggantian medium dilakukan setiap 2 hari untuk menyediakan
kembali nutrisi yang berkurang dan membuang sisa metabolisme sel. Kultur
dilakukan selama 11 hari atau sampai mencapai konfluen 90%.
Pembuatan dan Koleksi Conditioned Medium
Kultur yang telah konfluen dilakukan koleksi medium. Medium kultur
primer dibuang dan dicuci dengan PBS tanpa FBS. Selanjutnya diganti dengan
mDMEM tanpa FBS pada masing-masing petri sebanyak 2 ml. Setelah 2 hari
medium dikoleksi dan disimpan dalam tabung eppendorf 1,5 ml pada refrigerator.
Evaluasi Hasil Kultur Sel Otak
Tipe-tipe Sel
Identifikasi tipe-tipe sel yang tumbuh dilakukan berdasarkan morfologi sel
baik secara natif maupun dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE). Kultur sel
yang ditumbuhkan di atas cover glass dicuci menggunakan PBS kemudian
difiksasi dalam larutan buffer paraformaldehid 4% selama 24 jam. Setelah 24 jam
dilakukan penyimpanan dalam alkohol 50% selama 2 jam kemudian dalam
alkohol 70% sampai dengan dilakukan pewarnaan HE. Kultur yang disimpan
dalam alkohol 70% sebelum diwarnai dilakukan stopping point dalam alkohol
50% selama 3 menit. Selanjutnya direndam dalam aquades selama 5 menit,
hematoksilin 4 menit, dan dibilas dengan aquades. Selanjutnya dilakukan
perendaman dalam eosin selama 2 menit dan dibilas dengan aquades. Pewarnaan
dilanjutkan dengan dehidrasi bertingkat dalam alkohol 70%, 80%, 90%, 96%,
absolut 3 kali ulangan, masing-masing 10 menit dan dilanjutkan dalam xilol dua
kali ulangan kemudian dimounting pada object glass menggunakan entelan.
Evaluasi dilakukan dengan mengamati morfologi sel dengan mikroskop cahaya
pada perbesaran 40x10.
Tingkat Proliferasi dan Population Doubling Time
Tingkat poliferasi ditentukan berdasarkan penghitungan jumlah sel
sebelum dan setelah kultur mencapai konfluen 90%. Peningkatan (proliferasi) sel
diketahui dari total sel yang tumbuh menggunakan kamar hitung hemositometer
Improved Neubauer dengan perhitungan sebagai berikut:
Total sel (sel /ml) = jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengenceran x 104
Sedangkan Population Doubling Time (PDT) dihitung menggunakan rumus:
PDT (hari) =
1
( log jumlah sel akhir- log jumlah sel awal) x 3,32
waktu
Pertumbuhan Panjang Akson dan Dendrit
Pertumbuhan panjang akson dan dendrit diamati dengan mikroskop pada
perbesaran 40x10 dan diukur menggunakan mikrometer. Satu skala mikrometer
pada perbesaran 40x10 setara dengan 2,5 µm. Jumlah sel yang diukur sebanyak 50
sel untuk masing-masing ulangan.
Identifikasi Protein Menggunakan Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrilamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Elektroforesis diawali dengan pembuatan gel poliakrilamid yang terdiri
atas dua bagian yaitu separating gel 12% dan stacking gel 4%. Selanjutnya
chamber alat elektroforesis diisi dengan running buffer 1x sampai bagian bawah
gel terendam. Sampel dari CM kultur sel saraf sebanyak 15 µl dicampurkan
dengan loading buffer (1:2) dan dimasukkan ke dalam sumur gel. Larutan baku
protein dimasukkan juga ke dalam gel sebagai marker. Elektroforesis dijalankan
pada tegangan 120 V dan arus listrik sebesar 25 A selama 3 jam. Setelah proses
running selesai, gel dilepaskan secara hati-hati dari lempeng kaca dan selanjutnya
dilakukan visualisasi protein dengan pewarnaan silver nitrat.
Rancangan Percobaan
Kultur sel-sel saraf dibagi menjadi dua kelompok perlakuan berdasarkan
kondisi medium yang digunakan yaitu (1) mDMEM dan (2) mDMEM yang
ditambah dengan ITS (insulin 5 µg/ml, transferin 10 µg/ml, selenium 5 µg/ml)
masing-masing sebanyak tiga kali ulangan. Parameter yang diamati adalah tipe
sel yang tumbuh berdasarkan morfologi, panjang akson dan dendrit, komposisi
sel saraf dan sel glia, tingkat proliferasi sel dan population doubling time, serta
kandungan protein yang disekresikan. Data tipe-tipe sel berdasarkan morfologi sel
serta gambaran protein diuraikan secara deskriptif sedangkan data kuantitantif
yaitu tingkat proliferasi, PDT dan panjang akson-dendrit dianalisis menggunakan
metoda statistik T-test dengan tingkat kepercayaan 95%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tipe-tipe Sel yang Tumbuh dan Berkembang dalam Kultur