I. Prinsip Prinsip penetapan kadar protein dalam serum dengan

I. Prinsip
Prinsip penetapan kadar protein dalam serum dengan metode Biuret adalah
pengukuran serapan cahaya kompleks berwarna ungu dari protein yang bereaksi
dengan pereaksi biuret dimana, yang membentuk kompleks adalah protein dengan
ion Cu2+ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi
intensitas cahaya yang diserap oleh alat maka semakin tinggi pula kandungan
protein yang terdapat di dalam serum tersebut.
II. Dasar Teori
Protein berasal dari kata Yunani kuno proteos yang artinya “yang utama”. Dari asal
kata ini dapat diambil kesimpulan bagaimana pentingnya protein dalam kehidupan.
Protein terdapat pada semua sel hidup, kira-kira 50% dari berat keringnya dan
berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber energi,
penyangga racun, pengatur pH, dan bakan sebagai pembawa sifat turunan dari
generasi ke generasi (Girindra, 1993).
Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi. Protein sederhana hanya
mengandung asam-asam amino. Protein kompleks mengandung bahan tambahan
bukan asam amino, seperti derivat vitamin, lipid atau karbohidrat. Protein berperan
pokok dalam fungsi sel. Analisis terhadap protein dan enzim darah tertentu
digunakan secara luas untuk tujuan diagnostik (Harper, 1995).
Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip dari metode biuret
ini adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu
dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa (Carprette, 2005).
Reaksi biuret terdiri dari campuran protein dengan sodium hidroksida (berupa
larutan) dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari reaksi ini. Reaksi ini
positif untuk 2 atau lebih ikatan peptida (Harrow, 1954).
Penyerapan cahaya oleh protein disebabkan oleh ikatan peptida residu ritosil,
triptofonil, dan fenilalanin. Juga turut dipengaruhi oleh gugus-gugus non-protein
yang mempunyai sifat menyerap cahaya. Penyerapan maksimum albumin serum
manusia terlihat pada panjang gelombang kira-kira 230 nm (peptida) dan dengan
puncak lebar pada 280 nm karena serapan residu-residu asam amino aromatik.
Spektrum absorbansi suatu larutan protein berfariasi tergantung pada pH dan
sesuai denagn ionisasi residu sama amino (Montgomery, 1993).
Kerugian dari metode ini adalah hasil penetapannya tidak murni menunjukkan
kadar protein, melainkan bisa saja kadar senyawa yang mengandung benzena,
gugus fenol, gugus sulfhidrin, ikut terbaca kadarnya. Selain itu, waktu penetapan
yang dipergunakan juga lama, sehingga sering kali kurang effektif (Lehninger,
1982).
III. Alat dan Bahan
a. Alat
§ Tabung reaksi
§ Rak tabung reaksi
§ Pipet tetes
§ Pipet mikro
§ Spektrofotometer UV-Vis
b. Bahan
§ Standar protein
§ Serum
§ Pereaksi biuret
o K-Na-Tartrat 0,18 M
o CuSO4
0,012 M
o NaOH
0,2 M
IV.
Cara Kerja
1. Disiapkan 3 buah tabung reaksi di dalam rak tabung dengan masing-masing
tabung diberi nama Blanko, Standar dan Sampel
2. Disiapkan larutan Blanko, Standar dan Sampel di dalam tabungnya masingmasing dengan campuran sebagai berikut:
Blanko
Standar
Standar
20 mikroliter
Serum
Reagen Biuret
Sampel
20 mikroliter
1000 mikroliter
1000 mikroliter
1000
mikroliter
3.
Bahan-bahan di atas dicampur, lalu didiamkan selama 15-30 menit
4. Campuran dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer
dengan panjang gelombang 546 nm.
V.
·
Hasil
Absorbansi standar dari panjang gelombang 546 nm :
Tabung
Absorbansi
Standar
0,463
Tes
0.600
Pengamatan :
Absorban standar= 0.463
Absorban sampel= 0.600
Konsentrasi standar= 5 g/dL
Perhitungan :
Konsentrasi sampel= (Absorban sampel/Absorban standar)xKonsentrasi Standar
Konsentrasi Standar= (0.600/0.463)x5 g/dL=6.5 g/dL
VI. Pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan penetapan kadar protein dengan metode Biuret
dengan menggunakan spektrofotometer. Dimana prinsip dari metode ini adalah
pengukuran serapan cahaya kompleks berwarna ungu dari protein yang bereaksi
dengan pereaksi biuret dimana, yang membentuk kompleks adalah protein dengan
ion Cu2+ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi
intensitas cahaya yang diserap oleh alat maka semakin tinggi pula kandungan
protein yang terdapat di dalam serum tersebut.
Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang pertama
adalah CuSO4 dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion
Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua
adalah K-Na-Tartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada
Cu2+ sehingga tidak mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana
fungsinya adalah membuat suasana basa. Suasana basa akan membantu
pembentukan Cu(OH)2yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH–.
Pada saat sampel dikocok, jangan sampai menimbulkan buih karena akan
mempengaruhi pengukuran absorbansi. Dan setelah ditetesi pereaksi biuret, sampel
didiamkan selama 15-30 menit. 15-30 menit ini merupakan operating time yaitu
waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan
reagen. Setelah 15-30 menit, maka sampel diukur absorbansinya dengan alat
spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm. Panjang gelombang 546 nm
merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu. Reaksi yang
terjadi pada penetapan kadar protein dengan metode Biuret adalah :
CuSO4.5H2O + 2NaOH
Cu(OH)2+Na2SO4+5H2O
Cu2+ + 2OH–
Cu(OH)2
Setelah dilakukan pengukuran terhadap standar dan tes didapatkan absorbansi
larutan standar adalah 0,463 dan absorbansi larutan test adalah 0,600. Perhitungan
kadar protein dalam serum dilakukan dengan menggunakan rumus :
Kadar Protein total =
Sehingga didapatkan hasil kadar protein dalam serum adalah 6.5 g/dL. Kadar ini
berada dibawah kadar normal yaitu 7,2-8 gram/dL.
VII.
Kesimpulan
Kadar total protein dalam serum berada di bawah rentang normal (7,2-8 gram/dL).