EKOLOGI MIKROBA

VII. KARAKTERISASI GENOTIP 4
(Purifikasi produk PCR)
Tujuan Praktikum
1. Melakukan karakterisasi genotip spesies bakteri yaitu purifikasi
(pemurnian) produk PCR.
2. Memahami konsep dan menguasai cara melakukan pemurnian produk
PCR.
Teori Ringkas
Purifikasi produk PCR sangat penting dilakukan sebelum kita melangkah
pada proses downstrean berikutnya misalnya sebelum melakukan kloning
atau sebelum sikuensing DNA. Tujuan purifikasi ini adalah untuk
mendapatkan DNA dengan kualitas yang tinggi dengan cara menghilangkan
tiga pengotor utama yaitu primer oligonukleotida yang tidak digunakan pada
proses PCR, ”primer-dimers”, dan residu dNTPs. Tiga pengotor ini harus
dihilangkan karena: (1) Residu dNTPs jika bergabung dengan residu DNA
polymerase akan menggangu metode-metode yang dirancang untuk
cetakan/jahitan ”the end of amplified DNA” pada proses kloning, (2) kelebihan
primer oligonukleotida yang digunakan untuk menghasilkan ”amplified DNA”
mungkin akan menurunkan efisiensi PCR tahap berikutnya jika ”amplified
DNA” (produk PCR) ini digunakan sebagai template, dan (3) ”primer-dimers”
mungkin akan menyebabkan konsentrasi yang tinggi pada ”restriction sites”
yang akan berkompetisi dengan ”the termini of amplified DNA” pada proses
”cleavage”. Ada beberapa metode yang dapat digunakan pada proses
purifikasi yaitu: (1) Ekstraksi dengan fenol:kloroform (ini merupakan metode
yang lambat dan tidak efisien tapi sangat baik dan cocok untuk melakukan
proses purifikasi untuk purifikasi banyak sampel secara bersamaan), (2)
metode kromatografi pada ”anionic silica gel resin”, dan (3) metode ”spin
dialysis” melalui ”porous membrane”. Untuk itu, dalam praktikum ini,
mahasiswa diperkenalkan menggunakan 1 macam Kit untuk memurnikan
produk PCR yaitu dari Promega Corp. (WizardR PCR Preps DNA purification
Kit).
Bahan dan alat
- Produk PCR (PCR-amplified 16S rRNA) dari spesies bakteri.
- Pipet eppendoff 20-200 uL dan 1000uL
- Tip kuning (2 uL) dan biru (1 mL)
-
Baskom untuk es dan es
Vortex
Sentrifuge
Tube eppendoff (1.5 mL)
Promega WizardR PCR Preps DNA purification Kit
Ketentuan Per Kelompok
Tiap 5 kelompok akan melakukan purifikasi 1 produk PCR.
PROSEDUR PRAKTIKUM:
Promega WizardR PCR Preps DNA purification Kit (terlampir).
Catatan :
Harap selalu menggunakan sarung tangan selama proses purifikasi.
Pertanyaan :
1. Jelaskan tujuan purifikasi produk PCR!
2. Sebutkan 3 pengotor yang ada pada produk PCR dan mengapa harus
dihilangkan!
3. Sebutkan metode-metode purifikasi produk PCR!.
2