Tugas Dasbiotek-Yeti Siti Fatonah

Yeti Siti Fatonah
125100600111013
Kelas K
PCR
1.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi)
DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat
menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai
teknik lain yang menggunakan DNA. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan
metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Teknik PCR didasarkan pada
amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap
siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat.
2. PCR dibedakan menjadi 2, yaitu PCR konvensional dan Real Time PCR
- PCR konvensional
Perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu
tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Tahap deteksi dapat
dilakukan dengan beberapa cara (format), salah satunya menggunakan elektroforesis gel
kemudian dilanjutkan dengan hibridisasi pada membran menggunakan reagen pelacak atau
hibridisasi dalam tabung reaksi. Jika yang diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA maka
DNA dapat langsung diperbanyak, tetapi jika yang diisolasi berupa RNA, maka diperlukan tahap
tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu tahap transkripsi balik. Dalam hal ini,
metode yang digunakan disebut RT-PCR (reverse-transcription PCR).
- Real-time PCR
Tahap deteksi dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan).
Beberapa keunggulannya yaitu deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga
hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi
dilakukan menggunakan pelacak bertanda fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan
kespesifikan hasil. Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang
tinggi. Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang
linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam
spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR
yaitu Cobas Taqman.
3.
Prinsip Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah DNA yang telah
diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus
amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :
(1) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda
(dsDNA) misalnya SyBr Green, dan
(2) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar
(flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi)
4.
5.
dan probe Taq Man.
Reverse Transkriptase-PCR prinsip kerjanya menggunakan sepasang primer, yang
berkomplemen dengan sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut
kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan menghasilkan sebuah
untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya mengikuti amplifikasi logaritmik.
Prinsip kerja metode Elisa yaitu hidrolisis oleh enzim, yang berlangsung dalam waktu tertentu.
Reaksi berhenti bila ditambahkan asam atau basa kuat. Reaksi harus berlangsung dalam
keaadan optimal dimana kadar reaktan, temperatur, dan masa inkubasi yang telah ditentukan
secara eksperimental. Reaksi optimal sudah ditentukan secara eksperimental dengan penetapan
Yeti Siti Fatonah
125100600111013
Kelas K
kadar reaktan, temperatur, dan masa inkubasi. Setiap reagen dari fabrik berbeda, prosedurnya
berbeda.
TEKNIK REKAYASA GENETIKA
1.
2.
3.
4.
5.
DNA Sequencing adalah metode yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida
(adenin, guanin, sitosin, dan timin) pada molekul DNA. (Saat ini teknik DNA Sequencing telah
memasuki tahap baru yang mengarah pada skala besar atau high-throughput sequencing. Jutaan
bahkan milyaran basa nukleotida DNA dapat ditentukan urutannya dalam sekali putaran saja.
Hibridisasi merupakan proses persilangan untuk menghasilkan variasi baru. Persilangan
dilakukan dengan cara menyilangkan induk terpilih sebagai induk jantan atau betina, secar acak
maupun resiprok, dan persilangan dilakukan interspesifik maupun intergenerik. Tujuan
hibridisasi adalah untuk memperoleh kombinasi genetik yang diinginkan melalui persilangan dua
atau lebih induk yang berbeda genotipnya. Hibridisasi juga dapat diartikan persilangan antara
varietas dalam spesies yang sama yang memiliki sifat unggul. Hasil dari hibridisasi adalah hibrid
yang memiliki sifat perpaduan antara keduanya.
Prinsip kerja dari Southern Blotting adalah transfer molekul DNA yang telah dipisahkan oleh gel
elektroforesis ke membran nilon. Membran nilon adalah tempat hibridisasi antara sekuen
DNAspesisfik dengan probe. Kegunaan dari Southern Blot adalah untuk menganalisis
keberadaan mutan yang ada pada suatu organisme dan dapat diketahui ukuran dari gen yang
menjadi mutan pada organisme tersenonetheless
Northern blot memiliki prinsip kerja yang sama seperti wesstern blot tetapi menggunakan RNA
dan protein. Secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot, yang membedakan adalah
sampel yang digunakan, yaitu RNA. Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi (transkripsi)
suatu mRNA (gen) pada organ atau jaringan tertentu, seperti daun, bunga, biji, batang, dan
sebagainya. The only difference between a
Prinsip kerja Western blot yaitu mendeteksi perbedaan protein pada sampel jaringan. Gel
electrophoresis digunakan untuk spesifik protein. Mereka dibagi berdasarkan ukuran seperti
blot lainnya, hasilnya diblot kedalam kertas khusus. Langkah berikutnya mengikuti metode
ELISA.