Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan
advertisement
Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese Dr.Ozar SSanuddin,, Sp SpPK(K) K(K) Bagian Patologi Klinik F k lt kkedokteran Fakultas d kt r USU/UISU Medan Prinsip pemeriksaan Imunologis Umumnya berdasarkan pada interaksi antigen(Ag) dan antibodi(Ab). Interaksi dan antibodi I t k i antigen ti d tib di tba tb : - Tingkat primer. - Tingkat sekunder. tertier. - Tingkat tertier Tingkat primer ÆMerupakan awal reaksi ikatan molekuler antara Ag dan Ab ÆReaksi tidak terlihat dengan mata telanjang(biasa) ÆPerlu indikator indikator : - Radioisotop - Enzim atau - zat warna flouresen. Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab. Nama metode pemeriksaan pemeriksaan, untuk menentukan interaksi antara Ag dan Ab disesuaikan dengan nama indikator diatas. Ilmu yang mempelajari tentang reaksi Ag dan Ab Æ serologi Radioisotop ÆRadio Immuno Assay (RIA). Enzim Æ Enzyme Immuno Assay (EIA) Æ Elisa Fl Flouresen Æ Immunoflouresensi I fl i Metode ini untuk menentukan kadar Ag yang g rendah Æ ng g atau Ab y Tingkat sekunder Presipitasi Aglutinasi. Tingkat tertier Interaksi antara Ag dan Ab terjadi dalam tubuh manusia/ invivo. Teknik ELISA Untuk menentukan kadar Ag atau Ab. Ab Indikator berupa enzim dilenketkan pada Ag atau Ab. Ab Ada beberapa metode. Prinsip Metode Elisa Bila kita mau menditeksi Bil kit dit k i antigen(Ag): ti (A ) Ag(serum) + AbE ÆAg- AbE komplek Æ Æcuci i Inkubasi dengan substrat kromogenik ( (semula l ttakk b berwarna)Æ )Æ berwarna,bila b bil dihidrolisis oleh enzim Æintensitas warna yang terjadiÆdiukur dengan fotometer/ spektrofotometer Æ kadar antigen. Prinsip Metode Elisa[Sambungan] Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam a tu ttt ttt. waktu Reaksi berhenti bila ditambahkan asam atau a au basa kuat. ua Reaksi harus berlangsung dalam p dimana keaadan optimal - kadar reaktan - temperatur - masa inkubasi yang telah ditentukan secara eksperimental Æ setiap reagen dari fabrik ber beda Æprosedur berbeda. Reaksi optimal sudah ditentukan secara eksperimental,dengan penetapan - kadar reaktan t t - temperatur - masa inkubasi Æ setiap reagen dari fabrik berbeda Æprosedur berbeda. p Metode Elisa Metode kompotitif Non kompotitif [Langsung] Indirek I di k atau t sandwich d i h Metode kompotitif Æ Umumnya untuk menentukan Ag Ag. Æ Ab spesifik [dilekatkan pada partikel /sumur ] dicampur bersama sama Ag * Ætambahkan serum [Ag] yang akan b bersaing i d dengan A Ag*untuk * t k mengikat ik t Ab diatas Îkompleks Ag*-Ab-Ag Metode Elisa[sambungan] Non kompotitif[ Æ menentukan Ab atau Ag Indirek/sandwich Æ menentukan Ab dan Ag A Ab A tiAb* Æantibodi Æ tib di yang - Ag-Ab-AntiAb* dicari - Abs –Ag –Ab*ÆAg yang dicari Elektroforese Dikenalkan oleh Tiselius Tiselius,1930 1930 Æberkembang Æ menentukan protein serum dan urin Elektroforese merupakan teknik pemeriksaan yang berguna untuk pemisahan dan mengukur kadar makromolekul (protein) Komponen komponen El kt f Elektroforese Dapar/Buffer Media pendukung. - Media M di gell agarosa - Media selulosa asetat Power suply unit Pewarna Protein Densitometer Power suply unit Æ Menghasilkan energi pada kedua pergerakan g dan elektroda Æ p pemisahan molekul protein. Æ Tegangan dan besar arus dapat dikendalikan. Pewarna Protein Panceou red amino black Coomassie blue C i bl Densitometer Alat pengukur kuantitas berdasarkan intensitas warna pita pada elektroforese, saat media pendukung melalui sistem optik yang bekerja seperti fotometer Prinsip Dasar Elektroforese Tergantung pada : A. Muatan partikel B. B Kecepatan K t migrasi. i i A. Muatan : Partkel bermuatan, dalam media pendukung nya, listrik, akan nya bila terpapar dengan medan listrik bergerak kearah elektroda yang berlawanan. Molokul protein bersifat ampoter ampoter. Bila protein berada pada lingkungan pH dibawah titik iso elektrisnyaÆprotein y p akan bermuatan neto positip dan sebaliknya Pada pH isoelektrik protein tidak bermuatan listrik atau muatannya nol B. Kecepatan Migrasi Migrasi. Kecepatan migrasi protein tergantung pada : 1.Kekuatan medan listrik. Makin besar perbedaan muatan neto Æmakin cepat gerakan. 2.Ukuran molekul : Makin kecil mol Æmakin cepat gerakan 3.Media pendukung : Pori pori media bersifat filter. 4 Viscositas media 4.Viscositas Makin tinggi viscositas Æmakin lambat gerakan 5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik besarÆmigrasi cepat cepat. 6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukung pendukung. 7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah Æ migrasi cepat 8.Suhu: suhu tinggi Æ migrasi cepat. 6.Endoosmosis: yaitu gerakan berlawanan arah dalam p g media pendukung. 7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah Æ migrasi cepat 8.Suhu: suhu tinggi Æ migrasi cepat. Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis Dengan gel agarosa : - Prealbumin - Albumin - Alfa 1 globulin - Alfa 2 globulin g - Beta globulin - Gama globulin Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita it yang spesifik ifik lletaknya t k Æ dan d digambarkan densitometer berupa kurva Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita yang spesifik letaknya. Densitometer Æmenghasilkan fraksi protein berupa kurva Berdasarkan Pergerakan SPE Prealbumin - Fraksi bermigrasi F k i protein t i yang b i i paling li dekat ke anoda. Albumin, - Fraksi p protein terbanyak. y - Fungsi mempertahankan tekanan osmotik Alfa1 globulin Alfa 2 globulin. Beta1globulin. B t 1 l b li Beta 2 globulin. Gamma globulin migrasi terdekat ke katoda. Polymerase Chain Reaction(PCR). ym ( ). Metode yang cepat dan sederhana sederhana, untuk mengkopi dan memperbanyak urutan DNA spesifik yang dinginkan dan divisualisasikan sebagai pita yang jelas pada agarose gel gel. Scara mendasar sebenarnya PCR mengulangi siklus : - Denaturasi - Hibridasi dari DNA yang dinginkan d b t DNA primer i dengan bantuan - Extensi regio DNA tsb oleh enzim DNA polymerase. Pada PCR konvensional - Target amplifikasi adalah asam nukleat harus dilakukan terlebih dahulu sampai selesai B didit k i - Baru diditeksi. Pada PCR yang baru amplifikasi dilakukan terhadap sinyal sedangkan target asam nukleat tidak diamplifikasi. Pada PCR yang baru Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal. Target T t asam nukleat kl t tidak tid k di amplifikasi. Prinsip PCR 1 Ekstraksi DNA 1. 2. Alat PCR a. Target g DNA b. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA danTaq DNA polymerase c Denaturasi DNA c. Initial denaturation : 5 menit,t 94 C Denaturation : 1 menit 94 C Primer annealing : 1 menit 50 C Copying of DNA by DNA polymerase fi l elongation final l ti 10 menit it ,72 72 C Program g alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklus
