sripsi bagian inti jadi

9
BAB 3
PERCOBAAN
3.1 Alat, Bahan dan Miroba
3.1.1 Alat
Bunsen, inkubator 37oC, sentrifuga (Mikro 200R Hettich), Eppendorf 100 ul, 500 ul, 1,5
mL, tabung mikrosentrifuga (Eppendorf), neraca timbang (Mettler Toledo, PB303),
inkubator goyang, vortex, 2720 Thermal cycler (Applied Biosystem), Ose, pinset,
elektroforesis DNA (Tipe EPS 200 Pharmacia Biotech), laminar air flow (the Germfree
Laboratries Inc, model BBF6 S/N 6C-15-B-4119, USA), pipet mikro, oven pengering
(Heraus, tipe B 5402), otoklaf (All American Model 25X Amerika), sarung tangan, tip,
tangas air, lampu ultraviolet (UVP model R-25G), penentu urutan nukleotida otomatis.
3.1.2 Bahan
Kristal violet, etanol 90%, amonium oksalat, iodium, kalium iodida, safronin, tryptone,
yeast extract air suling atau air suling ganda, nutrien agar (NA), Taq DNA polimerase (MD
Bio), bufer Taq (MD Bio), deoksinukleotida trifosfat ‘dNTP’ (MD Bio), MgCl2 (MD Bio),
kit GFXTM(Amersham), agarosa (Boehringer Mannhein), larutan dapar TAE (Tris base,
EDTA, asam asetat glasial), etidium bromida (Merck), T4 DNA ligase (Amersham), dapar
ligase (Amersham), vektor pGEM-T Kit (Promega), media Luria Bertani ekstrak ragi
(Difco), tripton (Difco), NaCl (Merck)), bakto agar (Difco), ampisilin (Sigma), 5-bromo-4chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
(X-Gal)
(Sigma),
Isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside (IPTG) (Sigma), asam etilen diamin tetraasetat (EDTA) (Merck),
sodium dodesil sulphate (SDS) (Merck), natrium asetat (Merck), natrium hidroksida
(Merck),
sukrosa (Merck), enzim restriksi NdeI (Roche),
kalsium klorida, Tris-Cl
(Merck), etanol absolut (Merck), marka DNA 1kb (MD Bio), serbuk kitin koloid, asam
asetat glasial dan natrium asetat trihidrat, primer BactF1 (5’ggt tac stt gtt acg act t 3’),
primer UniB1 (5’ aga gtt tga tct tgg tct cag 3’) primer ChiFwd (5’ ggc gat cgt tgc tgc gtt ttt
3’), dan primer ChiRev (5’ gcc ggc cgg gtt ctt cca gtt 3’).
3.1.3 Mikroba
C. violaceum, Bacillus cereus dan E. coli JM 109
10
3.2 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dilakukan terhadap C. violaceum dan B. cereus. Pewarnaan Gram
bertujuan untuk mengkonfirmasi bakteri yang digunakan dan sebagai informasi yang
dibutuhkan pada proses isolasi kromosom menggunakan kit reagen Wizard. Kultur bakteri
semalam (16-18 jam) dipindahkan pada media baru dan diinkubasi kembali selama empat
jam, kemudian disentrifuga hingga didapat pelet bakteri. Pada kaca objek bersih, satu Ose
aquades diteteskan, kemudian ditambahkan satu Ose koloni dari pelet bakteri, tunggu
hingga mengering. Kemudian larutan kristal violet diteteskan hingga menutupi suspensi
bakteri yang telah kering, dibiarkan selama 1 menit, larutan kristal violet dibuang, suspensi
dibilas dengan larutan lugol. Larutan lugol diteteskan hingga menutupi suspensi, biarkan
selama 30 detik, lapisan lugol dibuang, dibilas dengan etanol hingga warna ungu hilang.
Fuschine basa diteteskan hingga menutupi suspensi bakteri, biarkan selama 30 menit,
lapisan fuschine dibuang kemudian dibilas dengan air biarkan hingga mengering. Hasil
pewarnaan diamati di bawah mikroskop dengan cara memperhatikan warna dan bentuk sel
bakteri.
3.3 Amplifikasi dan Penentuan Urutan Nukleotida Gen Pengkode 16s rDNA
PCR dilakukan dengan komposisi sebagai berikut: Bufer Taq polymerase 10 X tanpa
MgCL2 2,5 µL, dNTP 200µM 0,5 µL, MgCl2 25 mM 2,5µL, primer UniB1 20 µM 1µL,
primer BactF1 25 µM 1 µL, Taq polimerase 0,2 µL, hasil isolasi kromosom (pengenceran
1:20) 0,5 µL dan air MilliQ 16,8 µL untuk setiap 25 µL reaksi. Proses denaturasi awal
dilakukan pada suhu 94°C 5 menit, amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus dimana setiap
siklus terdiri atas tahap denaturasi pada suhu 94°C 1 menit, penempelan primer 48°C 1
menit dan polimerisasi 72°C 1 menit, dan polimerisasi akhir 72°C 10 menit. Produk PCR
dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% pada tegangan 80 V selama 60 menit.
3.4
Uji Kualitatif Aktivitas Kitinase dalam Media NA yang mengandung suspensi
Kitin Koloid
3 g NA, 0,5 g NB dan 100 mg kitin koloidal dilarutkan dalam 100 mL aquadest, media
disterilisasi dan dituang dalam cawan petri. Media dibagi menjadi 3 daerah sama besar,
daerah pertama diteteskan 5 µL suspensi bakteri E. coli JM sebagai kontrol negatif, daerah
kedua teteskan 5 µL suspensi bakteri Bacillus .cereus, daerah ketiga teteskan 5 µL suspensi
bakteri C. violaceum. Inkubasi media dilakukan pada suhu 32°C selama 10 hari.
11
3.5 Amplifikasi Fragmen Gen Pengkode Kitinase
PCR dilakukan dengan komposisi sebagai berikut: Bufer Taq polimerase tanpa MgCL2
10X 2,5 µL, dNTP 0,5 µL, MgCl2 2,5 µL, primer ChiFwd 1 µL, primer ChiRev 1 µL, Taq
polimerase 0,5 µL, kromosom (pengenceran 1:20) 0,5 µL dan air MilliQ 16,8 µL untuk
setiap 25 µL reaksi. Proses denaturasi awal dilakukan pada suhu 94°C 5 menit, amplifikasi
dilakukan sebanyak 30 siklus dimana setiap siklus terdiri atas tahap denaturasi pada suhu
94°C 1 menit, penempelan primer 52°C 1menit, polimerisasi 72°C 1,5 menit dan
polimerisasi akhir 72°C 10 menit. Produk PCR dielektroforesis menggunakan gel agarosa
1% pada tegangan 80 V selama 60 menit.
3.6 Kloning Produk PCR Kitinase pada pGEM-T dalam E. coli JM 109
Produk PCR diligasikan pada vektor kloning pGEM-T kemudian ditransformasi dalam
E. coli JM 109 kompeten. Seleksi biru putih dan resisten ampisilin dilakukan untuk seleksi
klon, kemudian plasmid diisolasi dari koloni putih yang dipilih. Karakterisasi plasmid
rekombinan dilakukan dengan metode analisa migrasi, analisa PCR, dan analisa
pemotongan dengan enzim restriksi. Penentuan urutan nukleotida DNA sisipan dilakukan
untuk mengetahui kebenaran klon.
3.6.1 Pembuatan Sel Kompeten
Satu buah koloni bakteri E.coli JM 109 dari media padat dikultur pada media LB cair,
kemudian diinkubasi selama satu malam (16-18 jam). Satu mL suspensi bakteri dalam LB
cair disubkultur dalam 9 mL LB cair segar kemudian inkubasi 2-3 jam pada suhu 37°C 150
rpm. Satu mL subkultur dipindahkan ke dalam Eppendorf 1,5 mL steril, dinginkan dalam
es selama 10 menit, kemudian disentrifuga 8000 rpm 5 menit pada suhu 4°C. Supernatan
hasil sentrifuga dibuang, kemudian pelet sel dicuci dengan 0,5 mL CaCl2 0,1 M dingin
steril, kemudian diinkubasi dalam es selama 10 menit, kemudian disentrifuga 8000 rpm 5
menit pada suhu 4°C. Supernatan hasil sentrifuga dibuang, pelet sel diresuspensi dengan 50
µL CaCl2 0,1 M dingin steril kemudian diinkubasi 12-24 jam pada suhu 4°C.
12
3.6.2 Ligasi Vektor pGEM-T dengan Produk PCR Kitinase
Jumlah produk PCR yang akan digunakan harus dihitung menggunakan rumus:
ng vektor x kb DNA sisipan
x rasio DNA sisipan : vektor
kb vektor
Komposisi campuran reaksi yang dicampurkan dalam tabung Eppendorf setelah
perhitungan terangkum dalam tabel 3.1, kemudian campuran reaksi diinkubasi 24 jam pada
temperatur 37°C.
Tabel 3.1
Komposisi Campuran Reaksi Ligasi Vektor pGEM-T dengan Produk PCR
Kitinase
Kontrol +
Kontrol -
Sampel A
Sampel B
5
5
5
5
Vektor pGEM-T
1
1
1
1
Produk PCR
-
-
0,321
0,642
DNA insert (kontrol +)
2
-
-
-
T4 DNA ligase
1
1
1
1
Milli Q water
1
3
2,679
2,358
Bufer 2X rapid ligation, t4
DNA ligase
3.6.3 Transformasi
Hasil ligasi disentrifuga 3000 radian per minute satu menit untuk mengumpulkan seluruh
cairan ke dasar tabung. 2 µL hasil ligasi ditambahkan dalam tiap – tiap tabung Eppendorf
yang berisi sel kompeten. Tabung Eppendorf disimpan dalam es selama 20 menit,
kemudian dimasukkan dalam tangas air 42°C selama 45-50 detik untuk heat shock, segera
masukan kembali dalam es selama 2 menit. 950 µL LB cair ditambahkan ke dalam
campuran ligasi pada suhu kamar kemudian campuran diinkubasi selama 4 jam pada 37°C
150 rpm. Kultur bakteri disentrifuga 8000 rpm selama satu menit, kemudian 700 µL
supernatan dibuang. 50 µL kultur dituang ke dalam media padat LB yang mengandung
ampisilin, IPTG dan x-Gal kemudian diinkubasi semalam (16-18 jam) pada suhu 37°C
(untuk menghasilkan jumlah transforman yang lebih banyak, dapat digunakan 200 µL
kultur sel E. coli JM 109 kompeten).
13
3.6.4 Seleksi dan Karakterisasi Klon Rekombinan
Dari koloni bakteri yang tumbuh, dipilih koloni putih untuk dikarakterisasi lebih lanjut.
Plasmid dari koloni yang terpilih diisolasi menggunakan kit reagen Qiaprep dan
prosedurnya mengikuti Qiaprep kit manual. Plasmid yang telah diisolasi dikarakterisasi
menggunakan 3 metode analisa, yaitu analisa migrasi, analisa PCR dan analisa
pemotongan enzim restriksi. Analisis migrasi dilakukan dengan membandingkan jarak
migrasi elektroforesis antara plasmid rekombinan hasil isolasi di atas dengan plamid
pGEM-T tanpa DNA sisipan menggunakan agarosa 1% pada tegangan 80V selama 60
menit.
Analisa PCR dilakukan dengan komposisi reaksi sebagai berikut: Bufer Taq polimerase
tanpa MgCL2 10X 2,5 µL, dNTP 0,5 µL, MgCl2 2,5 µL, primer ChiFwd 1 µL, primer
ChiRev 1 µL, Taq polimerase 0,5 µL, hasil isolasi Qiaprep 0,5 µL dan air MilliQ 16,8 µL
untuk setiap 25 µL. Proses denaturasi awal dilakukan pada suhu 94°C 5 menit, amplifikasi
dilakukan sebanyak 30 siklus dimana setiap siklus proses denaturasi pada suhu 94°C 1
menit, penempelan primer 52°C 1 menit, polimerisasi 72°C 1,5 menit dan polimerisasi
akhir 72°C 10 menit. Produk PCR dielektroforesis agarosa 1% pada tegangan 80 V selama
60 menit.
Analisa pemotongan dengan enzim restriksi dilakukan dengan mencampurkan 10X
sure/cut bufer H 2,5 µL, plasmid rekombinan 0,9 µL, Enzim restriksi NdeI 1,5 uL dan
MilliQ water ad 25 µL. Satu campuran reaksi dibuat tanpa enzim restriksi sebagai kontrol
negatif. Campuran diinkubasi dalam suhu 37°C selama 1 malam ( 16-18 jam).