BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat Alat elektroforesis agarosa (Biorad

BAB 3
PERCOBAAN
3.1
Alat
Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid
Mini kit, inkubator goyang (GSL), jarum Ose bundar, kit GFX (GE Healthcare), kompor
listrik (Rommelsbacher), laminar air flow Cabinet (Microflow), lampu spiritus, lemari
pendingin -20ºC (Denpoo), Thermal Cycler (2720 Applied Biosystems), mikropipet
(Eppendorf), oven (LTE, Ltd), program DNAWorks ver2.4 dan VectorNTi, sentrifuga
(Mikro200R zentrifugen Hettich), tip, transluminator ultraviolet (Vilber lourmat), tabung
Eppendorf 1.5mL, tabung PCR 200 μL, tusuk gigi, dan alat Vortex.
3.2
Bahan
Agarosa (MD Bio), ampisilin, Bakto Tripton (Difco), Baktoagar (Conda), bromfenol biru,
Bovine Serum Albumin (BSA), buffer E, buffer Pfu 10x, buffer TAE, buffer Taq 10x,
dimetil formamida (DMF), dNTP, enzim restriksi EcoRI (Roche) dan HindIII (Promega),
enzim polimerase Taq (MD Bio), Escherichia coli JM109, etidium bromida (EtBr), etilen
diamin tetraasetat (EDTA), gliserol, High Fidelity DNA Polymerase (Pfu), isopropyl
β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), kalium klorida (KCl), kalsium klorida (CaCl2),
loading buffer, marka DNA 100 pb dan 1 Kilo basa(Kb) (MD Bio), media Luria Bertani
(LB) cair dan padat, magnesium klorida (MgCl2), miliQ water, natrium klorida (NaCl),
oligonukleotida (Biolabs), sodium dodecyl sulphate (SDS), sukrosa, T4 DNA ligase, vektor
kloning pGEM-T (Promega), X-Gal, dan ekstrak ragi (Difco).
15
16
3.3
Perancangan dan Sintesis Oligonukleotida Sintetik Daerah Pengkode IFNα2b
Sintetis
Perancangan 10 oligonukleotida untuk kedua rantai dengan panjang 61-74 pb dan memiliki
daerah tumpang tindih sebanyak 18-26 nukleotida dengan suhu penempelan (Tm) sebesar
60,35±2,11 ºC menggunakan program DNAWorks ver2.4 dan VectorNTi. Perancangan dua
primer pendek untuk amplifikasi daerah pengkode IFNα2b menggunakan program
komputer VectorNTi. Keseluruhan oligonukleotida disintesis dan dimurnikan secara
komersial oleh Biolabs.
3.4
Sintesis dan Amplifikasi Daerah Pengkode IFNα2b Sintetis
Sintesis dan amplifikasi dilakukan menggunakan metode PCR dua tahap, dimana pada
PCR tahap I menggunakan metode berbasis sintesis dua arah TBIO untuk sintesis daerah
pengkode IFNα2b sintetis yang dilanjutkan dengan PCR tahap kedua untuk amplifikasi
daerah pengkode IFNα2b sintetis. PCR tahap I menggunakan DNA polimerase Pfu,
sedangkan PCR tahap kedua menggunakan DNA polimerase Taq. PCR tahap I dilakukan
secara Hot Start yang terdiri atas tahap pradenaturasi awal pada suhu 95ºC selama 2 menit,
denaturasi pada suhu 95ºC selama 30 detik, penempelan pada suhu 54ºC selama 45 detik
dan pemanjangan pada suhu 72ºC selama 1 menit sebanyak 25 siklus dan diakhiri dengan
72ºC selama 10 menit. PCR tahap kedua terdiri atas tahap pradenaturasi awal pada suhu
94ºC selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94ºC selama 1 menit, penempelan pada suhu
50ºC selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72ºC selama 1 menit sebanyak 25 siklus
diakhiri dengan 72ºC selama 10 menit.
17
3.5 Karakterisasi Produk PCR menggunakan Elektroforesis Agarosa
Sebanyak 10 μL produk PCR dicampur dengan 2 μL loading buffer dielektroforesis
menggunakan gel agarose 2% (b/v) dengan tegangan 70 Volt selama kurang lebih 1 jam
dan menggunakan marka DNA 100 pb. Elektroforesis dilakukan sampai loading buffer
mencapai dua pertiga dari panjang gel. Setelah elektroforesis selesai, gel direndam dalam
etidium bromida (EtBr) selama 30 detik, serta direndam dalam aquades selama 15 menit
dan kemudian diamati di bawah sinar UV.
3.6
Purifikasi Daerah Pengkode IFNα2b Sintetik
Produk PCR setelah dielektroforesis dipurifikasi menggunakan kit GFX. Pita pada gel
dengan ukuran yang diinginkan dipotong menggunakan silet bersih kemudian ditimbang
beratnya di dalam tabung Eppendorf yang telah terlebih dahulu ditimbang beratnya dalam
keadaan kosong. Buffer pengikat sebanyak 10 μL untuk 10 mg gel ditambahkan ke dalam
tabung Eppendorf berisi potongan gel dan diinkubasi pada suhu 50ºC selama 15 menit
sampai gel mencair. Setelah inkubasi selesai, sampel dipindahkan ke dalam kolom GFX
dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit. Tabung berisi sampel disentrifuga dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada di dalam tabung pengumpul
dibuang dan kolom GFX dimasukkan kembali ke dalam tabung pengumpul.
Buffer pencuci sebanyak 500 μL ditambahkan ke dalam kolom GFX dan disentrifuga
kembali (13.000 rpm) selama 1 menit. Cairan pada tabung pengumpul dibuang kembali
dan kolom GFX dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf steril kosong. Buffer pengelusi
sebanyak 50 μL ditambahkan ke dalam kolom GFX dan disentrifuga (13.000 rpm, 25ºC)
untuk mengelusi DNA.
18
Hasil purifikasi kemudian dielektroforesis lagi menggunakan gel agarosa 2% (b/v) dengan
tegangan 70 Volt selama 1 jam dengan menggunakan marka DNA 100 pb. Setelah itu gel
direndam dalam EtBr dan kemudian diamati di bawah sinar UV.
3.7
Penentuan Urutan Nukleotida dan Ligasi Produk PCR Hasil Purifikasi
Penentuan urutan nukleotida dilakukan di Korea (Macrogen). Sampel yang dikirim berupa
produk PCR hasil purifikasi sebanyak 1,5 μg, primer forward dan reverse masing-masing 5
μL dengan konsentrasi 10 pmol/3 μL. Daerah pengkode IFNα2b sintetis yang telah
ditentukan urutan nukleotidanya kemudian diligasikan dengan vektor kloning pGEM-T
menggunakan T4 DNA ligase. Komposisi vektor : produk PCR yang digunakan adalah 1:3
dengan total volume 15 μL. Reaksi ligasi diinkubasi pada suhu 4ºC selama 1-2 hari.
3.8 Pembuatan Sel Kompeten Escherichia coli JM109
Koloni E. coli JM109 dari pelat agar dibuat kultur semalam dalam media LB cair dengan
kondisi inkubasi 37ºC, 150 rpm. Sebanyak 1 mL kultur E. coli JM109 ini kemudian
dipindahkan ke dalam 9 mL media LB cair segar dan diinkubasi kembali (37ºC, 150 rpm)
selama 2-3 jam. Setelah inkubasi, kultur sebanyak 1-1,5 mL dipindahkan ke dalam tabung
Eppendorf sebanyak yang dibutuhkan, kemudian didiamkan selama 10 menit di dalam es.
Tabung Eppendorf berisi E. coli JM109 kemudian disentrifuga dengan kecepatan 8000 rpm
selama 5 menit untuk menghasilkan pelet sel. Supernatan dibuang, dan pelet diresuspensi
kembali dengan CaCl2 0,1 M sebanyak 0,5 mL dan didiamkan kembali di dalam es selama
10 menit. Suspensi E. coli JM109 dalam CaCl2 kemudian disentrifuga kembali dengan
kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Pelet sel diresuspensi kembali dengan CaCl2 dingin
sebanyak 50 μL. Sel kompeten diinkubasi di dalam lemari es bersuhu 4ºC selama satu
malam.
19
3.9
Transformasi Hasil Ligasi ke dalam E. coli JM109
Hasil ligasi sebanyak 2,5 μL ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf berisi 200 μL sel
kompeten E. coli JM109. Tabung dibolak-balikkan secara perlahan dan didiamkan di
dalam es selama 20 menit. Setelah itu dilakukan proses induksi panas dengan cara
menginkubasi tabung berisi sel dan hasil ligasi pada suhu 42ºC selama 45-50 detik dan
kemudian langsung diinkubasi di es selama 2 menit. Media LB cair segar sebanyak 950
μL ditambahkan ke dalam tabung dan diinkubasi (37ºC,150rpm) selama 1,5 jam. Sebanyak
50 μL sel transforman diinokulasi dengan metode sebar ke permukaan pelat agar LB yang
mengandung ampisilin, IPTG , dan X-Gal. Pelat dibalik dan diinkubasi selama 1 malam
pada suhu 37ºC.
3.10
Seleksi dan Karakterisasi Klon Rekombinan
Pelat yang sudah diinkubasi diamati kemungkinan adanya koloni baik yang berwarna putih
atau biru. Plasmid -baik tanpa DNA sisipan ataupun dengan DNA sisipan- diisolasi dari
koloni putih menggunakan GeneAid High Speed Plasmid Mini Kit. Kultur E. coli JM109
yang mengandung plasmid dipeletkan dengan cara disentrifuga (13.000 rpm, 25ºC) selama
1 menit. Pelet sel diresuspensi dengan 200 μL buffer PD1 dan kemudian ditambahkan
buffer PD2 sebanyak 200 μL untuk melisiskan sel. Pencampuran dilakukan dengan cara
membolak-balikkan tabung sebanyak 10 kali, kemudian diinkubasi selama 2 menit pada
suhu kamar sampai terbentuk cairan jernih.
Buffer PD3 sebanyak 300 μL ditambahkan untuk menetralkan reaksi lisis sel. Campuran
disentrifuga selama 3 menit (13.000 rpm, 25ºC). Supernatan dipindahkan secara hati-hati
ke dalam kolom PD beserta tabung pengumpulnya dan disentrifuga selama 30 detik
(13.000 rpm). Cairan pada tabung pengumpul dibuang, kemudian sebanyak 400 μL buffer
20
W1 ditambahkan ke dalam kolom serta disentrifuga selama 3 detik (13.000 rpm). Cairan
pada tabung pengumpul dibuang dan 600 μL buffer pencuci dimasukkan dalam kolom dan
disentrifuga selama 3 menit (13.000 rpm). Kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf
kosong steril. Buffer pengelusi sebanyak 50 μL dimasukkan ke dalam kolom dan
disentrifuga selama 2 menit (13.000 rpm) agar DNA terelusi dari kolom.
Plasmid yang sudah diisolasi kemudian dilakukan analisis migrasi. Analisis migrasi
plasmid dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) dengan tegangan 70 Volt
sampai loading buffer mencapai dua pertiga dari panjang gel. Gel kemudian direndam di
dalam larutan EtBr dan kemudian diamati dengan sinar UV. Plasmid dengan migrasi yang
lebih lambat kemudian dilakukan analisis restriksi baik menggunakan satu jenis enzim
maupun dua jenis enzim sekaligus untuk memperkirakan panjang DNA sisipan
menggunakan enzim restriksi EcoRI dan HindIII. Komposisi reaksi antara jumlah plasmid
dengan enzim adalah 5-10:1. Reaksi digesti dengan enzim diinkubasi pada suhu 37ºC
selama satu jam. Hasil pemotongan dengan enzim dianalisis menggunakan elektroforesis
gel agarosa 1% (b/v). Gel kemudian direndam dalam EtBr dan hasilnya diamati di bawah
sinar UV. Setelah dilakukan analisis restriksi, dilakukan analisis PCR dengan kondisi yang
sama dengan kondisi untuk PCR tahap kedua. Penentuan urutan nukleotida dilakukan di
Korea (Macrogen). Sampel yang dikirim berupa plasmid pGEM-T rekombinan hasil isolasi
sebanyak 3 μg, primer forward dan primer reverse sebanyak 5 μL dengan konsentrasi 10
pmol/3 μL.