Latar Belakang Penyakit bintik putih atau WSSV merupakan

A. Latar Belakang
Penyakit bintik putih atau WSSV merupakan penyakit virus yang biasa menyerang udang.
Serangan WSSV ditandai dengan munculnya bercak-bercak putih di bagian karapas udang.
Penyakit ini dapat menyebabkan kematian yang berakibat pada gagal panen. Pencegahan
penyebaran virus dapat diatasi dengan mengidentifikasi udang yang terkena virus untuk
kemudian dilakukan pemusnahan pada udang yang terinfeksi. Identifikasi virus dapat
dilakukan dengan beberapa cara, salah satunya adalah menggunakan metode Polymerase
Chain Reaction atau PCR.
B. Tujuan
1. Siswa mampu menggunakan alat-alat PCR
2. Siswa mampu mengetahui cara identifikasi virus WSSV pada udang
3. Siswa mampu mengidentifikasi keberadaan virus WSSV pada udang.
C. Persiapan Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam proses identifikasi virus adalah serangkaian alat PCR
yang terdiri dari:
1.
Show Case;
2.
Dry Bath Incubator;
3.
Voertex;
4.
Centrifuge;
5.
Micropipette;
6.
Thermal Cycler;
7.
Cawan Petri;
8.
Elektroforesis;
9.
Kamera Digital
10.
Tips Pipet;
11.
Microtube;
12.
Sumpit;
13.
Tisu;
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam identifikasi HPIK golongan virus adalah :
1.
Sampel ikan atau udang;
2.
Lysis buffer;
3.
RNA Ekstraction Solution;
4.
Choloroform (CHCI3);
5.
ddH2O/aquadest steril/aquabidest;
6.
DEPC H2O;
7.
Isopropanol;
8.
Ethanol 95% dan 75%;
9.
RT-PCR Premix;
10.
6X loading Dye;
11.
Firs PCR Premix;
12.
Nested PCR Premix;
13.
Iqzyme DNA Polymerase;
14.
DNA marker;
15.
TAE buffer;
16.
Agarose;
D. Identifikasi Virus WSSV(White Spot Syndrome)
Tahap-tahap identifikasi virus WSSV dengan metode PCR adalah ekstraksi, amplifikasi,
elektrophoresis, dan pembacaan hasil. Tahapan yang dilakukan berdasarkan acuan IQ-2000TM
– WSSV.
1. Ekstraksi.
Ektraksi berfungi untuk memisahkan DNA/RNA dari dinding sel. Langkah kerja dalam
ektraksi DNA adalah :
1.
Masukkan Lysis Buffer sebanyak 500 µl ke dalam tube yang sudah diberi label;
2.
Masukan sampel kedalam tube, lalu gerus menggunakan sumpit sampai hancur;
3.
Lalu inkubasi pada dry bath incubator dengan suhu 950C selama 10 menit;
4.
Lalu dinginkan dengan suhu ruangan selama 3 menit;
5.
Sentrifugasi dengan 12000 RPM selama 15 menit;
6.
Lalu siapkan tube lain yang sudah diberi ethanol 75 % sebanyak 400 µl, lalu masukkan
supernatan sebanyak 200 µl kedalam tube tersebut;
7.
Vortex selama 20 detik dan sentrifugasi 12000 RPM selama 5 menit;
8.
Buang ethanol dan keringkan;
9.
Lalu larutkan menggunakan DEPC Water ddH2O;
2. Amplifikasi
Amplifikasi adalah suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu
secara ezimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Adapun langkah kerja dalam amplifikasi
virus WSSV adalah;
1.
Hitunglah banyaknya campuran yang akan dibuat dengan cara :
Y= sampel + 1(kontrol positif) x 1.1
2.
Hitunglah reagen yang dibutuhkan :
RT – PCR reaction Reagent mixture
a.
First PCR Premix
7,5µl
b.
1qzyme DNA polymerase
0,5µl
Nested PCR Reagent mixture
a.
Nested PCR Premix
14µl
b.
Iqzyme DNA polymerase
1µl
3.
Siapkan tabung 0,2;
4.
Beri kode pada microtube;
5.
Masukan 8 µl First PCR reaction reagent ke setiap tabung 0.2 ml;
6.
Tambahkan 2 µl sampel ekstraksi DNA;
7.
Masukan kedalam mesin thermalsysler dan mulai proses PCR;
8.
Setelah proses pertama, tambahkan 15 µl Nested PCR kedalam setiap tabung dan mulai
proses PCR;
3. Elektroforesis
Elektrophoresis merupakan tahapan akhir dalam proses PCR. Langkah-langkah kerja
dalam elektrophoresis adalah;
1.
Pembuatan agarose;
 Campurkan 0,3 gr bubuk agarose dengan TAE 1X sebanyak 15 ml untuk agarose
kecil sedangkan 0,6 gr bubuk agarose dan 30 ml untuk agarose besar;
 Campurkan pada erlenmeyer, lalu masukkan kedalam microwave untuk proses
pemasakan selama 80 detik;
 Lalu angkat dan tambahkan SYBR GREEN sebanyak 0,5 µl untuk proses pewarnaan
agarose;
 Lalu tuangkan pada cetakan, lalu pasang sisir untuk membentuk sumuran;
2.
Lalu masukkan agarose yang sudah dibuat ke dalam elektrophoresis;
3.
Usahakan agarose terendam TAE Buffer;
4.
Lalu masukan DNA sampel ke dalam sumuran ke-4 sebanyak 7 µl;
5.
Setelah itu masukkan kontrol (-) ke dalam sumuran ke-3 sebanyak 7 µl;
6.
Lalu masukkan DNA marker ke dalam sumuran ke-1 sebanyak 3-7 µl;
7.
Dan masukkan kontrol (+) ke dalam sumuran ke-2 sebanyak 7 µl;
8.
Lalu elektrophoresis selama 30 menit;
9.
Setelah itu letakkan agarose pada UV Transilluminator;
10.
Siapkan camera digital sebagai dokumentasi;
11.
Hidupkan camera digital, lalu nyalakan UV Transillumunato;.
12.
Ambil gambar sebagai hasil identifikasi;
4. Hasil Identifikasi Virus WSSV
Hasil pengujian WSSV dari udang Vannamei sebanyak satu sampel, ditampilkan pada
gambar berikut ini :
1
2
3 4
848
630
333
Keterangan Gambar :
1.
DNA marker (848, 630, 333 bp)
2.
Kontrol (+) WSSV
3.
Kontrol (-)
4.
Sampel udang Vannamei
5. Analisa hasil :

Hasil positif jika muncul Band pada ukuran 296 bp dan/atau 550 bp.

Hasil negatif jika muncul Band pada ukuran 848 bp.
Berdasarkan gambar di atas, sampel udang Vannamei yang diperiksa WSSV,
menunjukkan hasil negatif (-) WSSV, dikarenakan hanya muncul band pada ukuran 848 bp.