heteroplasmi dna mitokondria manusia

3 Metodologi Penelitian
Metode yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari lima tahapan, dimulai dengan
screening klon rekombinan yang diperoleh dari penelitian sebelumnya, penyiapan sampel
dengan lisis sel untuk mendapatkan templat DNA, amplifikasi DNA secara in vitro
menggunakan teknik PCR, pencampuran klon DNA yang memiliki variasi panjang poli-C,
sekuensing dengan metode Dideoksi Sanger untuk menentukan urutan nukleotida dan
analisis hasilnya dengan menggunakan program SeqmanTM versi 4.0.0 dari DNASTAR.
3.1 Peralatan dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan yang lazim
digunakan dalam penelitian biokimia dan rekayasa genetika.
3.1.1 Peralatan
Peralatan gelas yang digunakan meliputi gelas kimia, gelas ukur, labu takar, labu
Erlenmeyer, cawan petri, dan botol reagen (Pyrex AS, Duran, Schott, Jerman). Peralatan non
gelas yang digunakan meliputi Mikropipet Eppendorf dengan tip pipet mikro ukuran 2,5 μL,
10 μL, 100 μL, dan 1000 μL. Digunakan juga tabung mikro (Eppendorf, Jerman) ukuran 0,2
μL, 0,5 μL, dan 1,5 μL. Selain itu digunakan juga alat-alat lain seperti alumunium foil, dan
parafilm.
Alat pengukur massa menggunakan neraca analitis digital Explorer (Ohaus, AS). Sterilisasi
alat agar bebas bakteri menggunakan Autoclave Electric Pressure Steam Sterilized model
No.25 (All American, AS). Inkubasi media padat dengan menggunakan inkubator buatan
Fisher Scientifico, sedangkan untuk keperluan inkubasi dalam proses lisis digunakan
penangas air LKB Bromma 2219 multitemp. thermostatic circulator. Penyimpanan bahanbahan seperti reagen untuk PCR dan lisis, larutan hasil lisis dan hasil PCR menggunakan
deep freezer Caravell dengan suhu tetap yaitu -20 °C. Proses PCR menggunakan alat PCR
merek GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, AS). Analisis hasil PCR dengan
cara elektroforesis gel agarosa menggunakan perangkat elektroforesis Mini Dubcell GT BASe
DNA Biorad (Biorad, AS) dan untuk visualisasi hasil elektroforesis digunakan lampu UV
18
dengan panjang gelombang 312 nm. Gel hasil elektroforesis difoto dengan kamera digital
Olympus SP-700.
3.1.2 Bahan
Koloni-koloni dalam stok gliserol ditumbuhkan pada media Luria Bertani (LB) padat steril
(Bakto-tripton (Difco Lab) 1%, ekstrak bacto yeast (Difco Lab) 0,5%, NaCl (Merck) 1%, dan
bakto agar (Difco Lab) 1,5%) yang mengandung 100 μg/ml antibiotik ampisilin (LBA)
(Merck). Untuk screening klon rekombinan, koloni putih ditumbuhkan kembali pada media
padat LBA steril yang mengandung 50 μL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (Xgal) (Amersham Life Science) 20 mg/ml dan 100 μL isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG)
(Amersham Life Science) 100 mM.
Templat DNA diperoleh dengan melakukan lisis sel. Sampel koloni putih dari media padat
diambil dengan menggunakan tusuk gigi steril. Lisis sel menggunakan buffer lisis 1x (50
mM Tris-Cl pH 8,5; 1 mM EDTA pH 8,0; dan 0,5% (v/v) Tween 20), proteinase-K (100 μg
ml-1) dan ddH2O steril.
Komponen-komponen stok pereaksi PCR dengan merek MDBio, Inc. yaitu 5U μL-1 enzim
Taq DNA polimerase, dNTP 10mM, primer M-1 dan M-2 masing-masing 20 pmol μl-1,
buffer PCR 10x, Mg2+ 25 mM dan ddH2O steril. Primer M-1 (L15997) dan M-2 (H16401)
merupakan primer yang mengenali fragmen D-loop mtDNA yang berukuran 443 pb pada
posisi nukleotida 15978-16420 (Noer et al., 1994). Urutan nukleotida primer M-1 dan M-2
tercantum dalam Tabel 3.1. L menunjukkan pita light sedangkan H menunjukkan pita heavy.
Tabel 3.1 Urutan nukleotida primer M-1 dan M-2.
Primer
Urutan 5’Æ 3’
Posisi
Ukuran
M-1
CACCATTAGCACCCAAACCT
L 15978-15997
20 nukleotida
TGATTTCACGGAGGATGGTG
H 16420-16401
20 nukleotida
(L15997)
M-2
(H16401)
Analisis hasil PCR menggunakan gel agarosa 1,5% (b/v); 0,5 μg mL-1 EtBr, buffer
elektroforesis (running buffer) TAE 1x (40 mM Tris-asetat dan 1 mM EDTA pH 8,0
(Merck)), dan loading buffer (sukrosa 50% (Merck), 0,1 M EDTA dan 0,1% bromfenol biru
pH 8,0 (Pharmacia)). Sebagai penanda (marker) digunakan pUC19/HinfI 60 ng μL-1.
Penanda ini akan menghasilkan empat pita dalam gel elektroforesis yang masing-masing
berukuran 1419 pb, 517 pb, 397 pb, 214 pb, dan 75 pb.
19
3.2 Screening Klon Rekombinan
Koloni-koloni putih dua sampel dalam stok gliserol dari penelitian terdahulu ditumbuhkan
kembali pada media Luria Bertani (LB) padat steril. Inkubasi dilakukan selama 16-18 jam
pada 37 oC dalam inkubator buatan Fisher Scientifico. Koloni tunggal yang diperoleh
kemudian ditransfer ke media LBA padat steril yang mengandung 50 μL X-gal (20 mg/ml)
dan 100 μL IPTG (100 mM) dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-18 jam.
3.3 Penyiapan Templat DNA
Koloni putih dari media LBA+X-gal+IPTG diambil kemudian ditambahkan 30 μL buffer
lisis 10x, 10 μL proteinase-K (100 μg ml-1) dan ddH2O hingga 300 μL dalam tabung
eppendorf 1,5 mL (Innis dan Gelfand, 1990). Tabung eppendorf kemudian dibungkus
dengan parafilm dan diinkubasi pada 54 °C selama 1 jam kemudian enzim dideaktivasi pada
95 °C selama 15 menit. Setelah itu disentrifugasi 12.000 rpm selama 3 menit dan supernatan
digunakan sebagai templat DNA. Jika tidak segera digunakan maka disimpan dalam tabung
eppendorf 1,5 mL pada suhu -20 °C (Noer et al., 1994).
3.4 Amplifikasi DNA
Perbanyakan DNA dilakukan dengan PCR. Reaksi dilakukan dengan membuat master mix
dalam tabung eppendorf 0,2 mL dengan campuran yang terdiri dari 2,5 μL buffer PCR, 1,5
μL MgCl2, 0,5 μL dNTP yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP dan dTTP, 0,5 μL primer M-1
dan M-2 dan 0,2 μL Taq DNA Polymerase yang ditambahkan terakhir kali. Perbanyakan
dilakukan dengan menambahkan 5 μl templat mtDNA sampel kedalam 1x master mix.
Kontrol positif dibuat dengan komposisi reaksi yang sama tetapi templat yang digunakan
adalah sampel yang sebelumnya sudah memberikan hasil positif dalam proses PCR.
Digunakan juga kontrol negatif dengan campuran reaksi yang sama tetapi templat diganti
dengan ddH2O steril.
Proses PCR dilakukan dengan tahapan sebagai berikut, tahap denaturasi awal pada 94 °C
selama 1 menit, kemudian 30 siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri dari
denaturasi pada 94 °C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 50 °C selama 1
menit, perpanjangan rantai pada 72 °C selama 1 menit dan pemantapan pada 72 °C selama 4
menit (Puspasari, 1998). Hasil PCR disimpan pada suhu -20 °C.
20
3.5 Analisis Hasil PCR
Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dibuat dengan melarutkan
0,6 gr agarosa dalam 40 mL buffer TAE 1x kemudian dipanaskan hingga agarosa larut.
Larutan didinginkan hingga kira-kira mencapai suhu 60 °C dan ditambahkan 2 μL EtBr 10
mg mL-1. Campuran dituang ke dalam cetakan elektroforesis berukuran 6x10 cm yang
sebelumnya telah dipasang sisir pembentuk sumur dan didiamkan hingga membentuk gel
padat.
Hasil PCR diambil sebanyak 5 μL dan dicampur dengan 2 μL loading buffer kemudian
dimasukkan ke dalam sumur gel. Sebagai penanda (marker) DNA digunakan pUC19/HinfI
60 ng μL-1 sebanyak 5 μL dicampur dengan 2 μL loading buffer. Alat elektroforesis
dihubungkan dengan sumber arus listrik dan diatur pada tegangan 80 Volt selama 35 menit
menggunakan buffer TAE 1x sebagai running buffer. Pita DNA dianalisis dengan melihat
gel elektroforesis diatas sinar UV pada panjang gelombang 312 nm dan difoto dengan
kamera Digital
(Ratnayani, 2000). Pita hasil PCR dibandingkan dengan pita penanda
(marker) untuk mengetahui perkiraan konsentrasi hasil PCR.
Proses untuk memperbanyak hasil PCR dilakukan dengan cara melakukan PCR untuk
sampel yang sama berulang-ulang. PCR dilakukan terus hingga sampel berjumlah 600-1000
ng, dengan konsentrasi 15 ng μl-1 yaitu jumlah minimal untuk melakukan 1 kali reaksi
sekuensing.
3.6 Pencampuran Klon DNA
Sampel klon GMR 1 dan GMR 3 hasil PCR dikumpulkan hingga berjumlah antara 600 –
1000 ng. Kemudian masing-masing klon DNA tersebut dicampurkan dengan perbandingan
1:1, 1:2, dan 2:1.
3.7 Penentuan Urutan Nukleotida
Untuk keperluan penentuan urutan nukleotida, hasil PCR sampel klon GMR 1 dan GMR 3,
sampel hasil pencampuran klon DNA dan salah satu primer dengan konsentrasi 10 pmol/3 μl
disiapkan dalam tabung mikro lalu dibungkus dengan parafilm. Untuk satu kali reaksi
sekuensing dibutuhkan 2,5 μl primer dengan konsentrasi 10 pmol/3μl.
Penentuan urutan nukleotida (sekuensing) dilakukan oleh Macrogen Inc dengan
menggunakan metode Dideoksi Sanger dan mengikuti prosedur BigDye TM Terminator.
21
Produk yang terbentuk dimurnikan menggunakan metode presipitasi etanol. Urutan
nukleotida dibaca secara otomatis menggunakan alat Automatic Sequencer 3730xl. Data
yang diperoleh berupa elektroferogram dalam bentuk abi file. Masing-masing basa
nukleotida ditunjukkan oleh warna yang berbeda, yaitu basa A ditunjukkan dengan warna
hijau, basa G warna hitam, basa T warna merah, dan basa C warna biru. Selain
elektroferogram, diperoleh juga urutan nukleotida lengkap dalam bentuk arsip teks.
3.8 Analisis Hasil Sekuensing
Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan membandingkan urutan sekuensing sampel
terhadap urutan standar CRS menggunakan program SeqmanTM versi 4.0.0 dari DNASTAR.
Analisis terhadap urutan nukleotida menggunakan program SeqmanTM versi 4.0.0 dilakukan
dengan memasukkan urutan nukleotida standar CRS dan urutan nukleotida sampel lalu
program akan secara otomatis menandai basa pada posisi tertentu yang berbeda dengan basa
pada standar CRS. Elektroforegram yang dihasilkan dari proses sekuensing tidak selalu
akurat, terutama apabila terdapat puncak yang berhimpitan. Oleh karena itu, pembacaan
ulang secara manual untuk memperbaiki urutan nukleotidanya sangat diperlukan dan akan
mudah dilakukan dengan bantuan program SeqmanTM.
22