HETEROPLASMI DNA MITOKONDRIA MANUSIA

4 Hasil dan Pembahasan
Penyebab ketidakberhasilan penentuan urutan daerah HVSI mtDNA manusia yang
mengandung poli-C melalui direct sequencing dan keberhasilan sekuensing setelah kloning
diduga terjadi karena adanya fenomena heteroplasmi (Siti, 2005). Dalam bab ini akan
dipaparkan hasil dan pembahasan untuk menguji hipotesis tersebut dalam enam bagian besar
yang meliputi (1) Screening klon rekombinan, (2) Karakterisasi sampel, (3) Penyiapan
templat DNA, (4) Amplifikasi DNA, (5) Sekuensing sampel klon GMR dan hasil
pencampuran antara klon GMR 1 dengan GMR 3, dan (6) Analisis urutan nukleotida HVSI
dari sampel dengan melakukan perbandingan terhadap standar Cambridge Reference
Sequence (CRS).
4.1 Screening Klon Rekombinan
Tahapan screening ini dilakukan untuk melihat apakah klon-klon dari dua sampel hasil
penelitian sebelumnya (Dwiyanti, 2006), GMR 1 dan GMR 3, yang disimpan dalam stok
gliserol mengandung plasmid yang membawa DNA sisipan daerah HVSI mtDNA sepanjang
0,4 kb. Vektor plasmid yang digunakan adalah pGEM-T seperti ditunjukkan pada Gambar
4.1.
Gambar 4.1 Vektor pGEM-T
Vektor ini memiliki gen-gen yang penting untuk proses screening, diantaranya gen
resisten ampisilin (Ampr) dan gen lacZ yang mengkode β -galaktosidase. Daerah
HVSI mtDNA sepanjang 0,4 kb tersisipkan pada gen lacZ (Promega, 1998).
23
Vektor pGEM-T memiliki beberapa gen yang penting untuk proses screening, di antaranya
gen resisten ampisilin (Ampr) yang mengkode β -laktamase. Enzim ini akan mendegradasi
ampisilin sehingga bakteri yang membawa plasmid pGEM-T dapat tumbuh pada media yang
mengandung ampisilin. Gen penting lainnya adalah gen lacZ yang mengkode β galaktosidase. Gen lacZ ini diinduksi oleh senyawa IPTG (isopropylthio- β -D-galactoside).
Enzim β -galaktosidase dapat bereaksi dengan X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β -Dgalactoside), yaitu suatu senyawa tidak berwarna,
menghasilkan produk 5-bromo-4-
kloroindigo yang berwarna biru, sehingga jika bakteri pembawa plasmid ditumbuhkan pada
media mengandung IPTG dan X-gal akan terbentuk koloni berwarna biru. Penyisipan daerah
HVSI mtDNA manusia sepanjang 0,4 kb pada gen lacZ menyebabkan tidak
terekspresikannya β -galaktosidase, sehingga bakteri yang ditumbuhkan pada media
mengandung IPTG dan X-gal akan membentuk koloni berwarna putih dan bukan biru.
Atas dasar ini, setiap klon sampel GMR 1 dan GMR 3 ditumbuhkan pada media LBA yang
mengandung IPTG dan X-gal. Ilustrasi koloni biru dan putih ini ditunjukkan pada Gambar
4.2.
Gambar 4.2. Screening klon rekombinan
Koloni berwarna putih mengandung plasmid yang membawa DNA sisipan daerah
HVSI mtDNA manusia sepanjang 0,4 kb. Sedangkan koloni berwarna biru
mengandung plasmid yang tidak membawa DNA sisipan sehingga gen lacZnya masih
utuh dan dapat mengkode β-galaktosidase yang mengubah senyawa tidak berwarna
X-gal menjadi produk berwarna biru.
24
4.2 Karakterisasi Sampel
Data sampel klon DNA rekombinan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada
Tabel 4.1. Sampel yang digunakan berasal dari klon GMR yang telah ditumbuhkan dalam
media padat LBA.
Tabel 4.1 Karakterisasi sampel
No
Kode Sampel
Klon
GMR1
Perbandingan
GMR1
100%
Klon
GMR3
-
1
G10
2
G18
GMR3
-
100%
3
G1
Campuran GMR1 dan GMR3
50%
50%
4
G2
Campuran GMR1 dan GMR3
33.3%
66.7%
5
G3
Campuran GMR1 dan GMR3
66.7%
33.3%
Sampel yang digunakan berasal dari klon GMR1 dan GMR3 serta campuran antara keduanya dalam
berbagai perbandingan.
4.3 Penyiapan Templat Sampel
Koloni putih tunggal hasil screening pada media LBA+X-gal+IPTG diambil dan kemudian
dilakukan lisis. Lisis sel ini memanfaatkan senyawa kimia untuk memecah dinding atau
membran sitoplasma dan mengeluarkan seluruh isi sel termasuk DNA. Senyawa kimia
tersebut adalah buffer lisis dan Tween-20. Tween-20 adalah deterjen non-ionik yang dalam
larutannya membentuk micelles. Struktur molekul Tween-20 memiliki bagian hidrofilik yang
tersusun oleh senyawa ester atau alkohol dan bagian hidrofobik yang merupakan senyawa
hidrokarbon. Interaksi bagian hidrofilik micelles Tween-20 dengan senyawa fosfolipid dari
membran sel membuat senyawa fosfolipid membran larut membentuk campuran micelles
dengan Tween-20. Dengan demikian, Tween-20 berfungsi sebagai “emulgator” yang
membantu proses lisis dengan cara merusak struktur membran sehingga menyebabkan
kerusakan membran sel (Martasih, 1994).
Setiap enzim mempunyai suhu optimum yang khas. Dalam penelitian ini suhu yang
digunakan dalam tahapan lisis adalah 54 oC, yang merupakan suhu optimum bagi enzim
proteinase K. Penambahan proteinase K bertujuan untuk mendegradasi enzim-enzim DNAse
dan protein lainnya. Enzim proteinase K selanjutnya dideaktivasi pada suhu 95 °C selama 5
menit (Noer et al., 1994). Setelah inkubasi dilakukan sentrifuga agar molekul mtDNA
terpisah dengan molekul-molekul lainnya berdasarkan perbedaan massa karena massa
mtDNA yang kecil maka dengan sentrifugasi akan berada di sekitar bagian atas supernatan.
25
Jumlah mtDNA yang didapatkan melalui metoda ini belum memadai untuk kelancaran
analisis lebih lanjut, oleh karena itu diperlukan perbanyakan templat mtDNA menggunakan
metode PCR (Saputra, 2005). Ekstrak DNA hasil lisis dijadikan templat untuk PCR.
Konsentrasi templat yang terlalu tinggi akan mengakibatkan terbentuknya pita yang smear,
sebaliknya konsentrasi templat yang terlalu rendah akan menyebabkan terbentuknya pita
yang terlalu tipis untuk dapat dideteksi dengan metode elektroforesis gel agarosa.
Konsentrasi templat 10 ng/100 μL campuran reaksi dapat menghasilkan pita yang cukup
terang dan tebal (Marzuki dkk., 1991). Tabel 4.2 memperlihatkan hubungan antara jumlah
templat atau molekul target pada PCR dengan jumlah siklus PCR. Semakin banyak jumlah
molekul target semakin sedikit jumlah siklus PCR yang diperlukan (Innis dan Gelfand,
1990).
Tabel 4.2 Hubungan antara jumlah molekul target dengan jumlah siklus PCR
Jumlah molekul target
5
3 × 10
Jumlah siklus PCR
25 – 30
1,5 × 104
30 – 35
1 × 103
35 – 40
50
40 – 45
Semakin banyak jumlah molekul target semakin sedikit jumlah siklus PCR yang diperlukan (Innis dan
Gelfand, 1990).
4.4 Fragmen 0,4 kb Hasil Amplifikasi PCR
Proses perbanyakan DNA atau amplifikasi secara in vitro dalam penelitian ini dilakukan
dengan metode PCR, mengenai metode PCR telah diuraikan sebelumnya pada bab
metodologi penelitian. Proses PCR memiliki peranan penting dalam penelitian terhadap
DNA mitokondria. Komponen dan komposisi bahan sangat menentukan keberhasilan PCR.
Ketiadaan salah satu komponen akan membuat reaksi PCR tidak berjalan dan jumlah bahan
yang kurang atau terlalu berlebih akan memberikan hasil yang tidak diinginkan. Salah satu
komponen yang penting dan dipengaruhi oleh jenis templat DNA yang ingin diperbanyak
adalah primer. Fragmen yang ingin diperbanyak adalah HVSI dengan posisi nukleotida dari
16024 sampai 16383, maka primer yang digunakan adalah M1 dan M2. Kedua primer ini
akan menempel pada ujung fragmen HVSI dengan sisi penempelan mtDNA yang
berkebalikan dan akan memperpanjang kedua fragmen dengan arah yang berlawanan.
Kelebihan metode PCR ini hanya membutuhkan sampel dalam jumlah sedikit namun harus
diketahui urutan asam amino pada ujung segmen mtDNA untuk digunakan sebagai primer
26
dan membutuhkan kriteria khusus untuk primernya, yaitu: harus terletak pada arah yang
benar dan jumlah G-C lebih besar dari jumlah A-T untuk menunjukkan suhu penempelan
primer, suhu penempelan G-C lebih tinggi karena ikatan G-C rangkap tiga sehingga butuh
energi yang lebih besar untuk memutuskan ikatannya, ujung 3’ harus G atau C, bila dapat
primernya tidak mempunyai komplemen di untai lain selain untai awal, ujung-ujung jangan
saling berkomplemen karena dapat membentuk polindron atau loop, dan primer 1 jangan
merupakan primer 2.
Siklus PCR pada penelitian ini meliputi tiga tahap yaitu, tahap inisiasi atau denaturasi awal,
tahap ekstensi, dan tahap pemantapan. Tahap denaturasi awal dilakukan pada suhu 94°C
selama satu menit sebanyak satu kali. Tahap ekstensi terbagi menjadi tiga tahap yaitu; tahap
denaturasi pada suhu 94°C selama satu menit yang bertujuan untuk melepaskan semua ikatan
hidrogen yang menghubungkan dua rantai DNA sehingga menghasilkan DNA untai tunggal,
kemudian dilanjutkan oleh tahap penempelan primer (annealing) pada suhu 50°C selama
satu menit, dan setelah itu tahap perpanjangan rantai (elongation) pada suhu 72°C selama
satu menit. Ketiga tahap ekstensi ini dilakukan sebanyak 30 siklus. Terakhir adalah tahap
pemantapan, dilakukan pada 72°C selama empat menit yang bertujuan untuk meyakinkan
bahwa untai tunggal DNA yang tersisa sudah terkopi.
Faktor-faktor yang dapat menyebabkan kegagalan amplifikasi, diantaranya adalah adanya
kontaminan pada pelarut yang digunakan, adanya DNAase, tidak tepatnya jumlah
konsentrasi pereaksi yang digunakan, dan tidak tepatnya pengaturan kondisi PCR.
Penelusuran kegagalan amplifikasi ini dapat dilakukan jika setiap kali melakukan proses
PCR selalu diikutsertakan kontrol positif dan kontrol negatif. Timbulnya pita selain pita
primer pada kontrol negatif menandakan terjadinya kontaminan selama penyiapan reaksi
PCR (Innis dan Gelfand, 1990). Apabila hal tersebut terjadi maka reaksi PCR diulangi
dengan menggunakan pereaksi dan peralatan baru yang steril. Timbulnya pita spesifik pada
kontrol positif menandakan reaksi PCR berjalan dengan baik, sedangkan tidak adanya pita
spesifik menandakan reaksi PCR tidak berjalan dengan baik. Dengan melihat ada tidaknya
sisa primer, dapat ditelusuri penyebab kegagalan reaksi PCR. Tidak adanya pita spesifik dan
pita primer menandakan terjadinya inhibisi terhadap enzim Taq DNA polimerase yang dapat
disebabkan oleh kehadiran senyawa inhibitor pada larutan templat mtDNA. Untuk
menanggulangi masalah ini dapat dilakukan dengan mengencerkan larutan templat
sedemikian rupa sehingga senyawa inhibitor mengalami pengenceran. Inhibisi dapat pula
ditanggulangi dengan menambahkan enzim dalam jumlah lebih banyak ke dalam campuran
reaksi. Tidak munculnya pita spesifik tetapi muncul pita sisa primer menandakan jumlah
molekul templat tidak ada atau terlalu sedikit. Bila hal ini terjadi maka jumlah templat yang
digunakan harus diperbanyak (Paabo, 1990). Molekul templat yang terlalu sedikit atau tidak
27
ada dapat pula disebabkan oleh proses lisis yang tidak berjalan dengan baik. Karena itu perlu
dilakukan penyiapan templat DNA yang baru dengan cara mengulangi proses lisis sel. Tidak
munculnya pita spesifik karena jumlah templat DNA yang terlalu sedikit dapat ditanggulangi
dengan cara memasukkan kembali hasil PCR yang masih terdapat dalam Eppendorf ke
dalam mesin PCR dan diamplifikasi beberapa siklus. Reamplifikasi seperti ini umumnya
berhasil jika dilakukan maksimum 1 minggu setelah PCR yang pertama, dan tidak
diperlukan tambahan enzim Taq DNA polimerase (Chamberlain dkk., 1990).
Hasil amplifikasi dapat dilihat melalui metode elektroforesis gel agarosa. Dengan metode ini
maka dapat diketahui ukuran fragmen hasil PCR yang didapatkan. Penentuan ukuran hasil
PCR dilakukan dengan menggunakan penanda pUC19/HinfI. Proses amplifikasi melalui
proses PCR berhasil apabila kontrol positif memberikan hasil positif yaitu dengan
munculnya satu pita pada daerah 0,4 kb dan kontrol negatif memberikan hasil negatif yaitu
tidak munculnya pita pada gel serta sampel menghasilkan pita pada daerah 0,4 kb (lihat
Gambar 4.3).
Gambar 4.3 merupakan foto hasil elektroforesis gel agarosa terhadap dua sampel. Dapat
dilihat kontrol positif pada sumur dua memberikan satu pita berukuran 0,4 kb sedangkan
kontrol negatif pada sumur lima tidak menghasilkan pita. Sedangkan sumur tiga dan empat
yang merupakan sampel hasil perbanyakan PCR menunjukkan satu pita berukuran 0,4 kb.
Primer M1 dan M2 yang khusus dirancang untuk mengamplifikasi daerah HVSI terbukti
mampu mengamplifikasi fragmen mtDNA pada urutan nukleotida 16024 – 16383. Hal ini
dapat terlihat pada hasil elektroforesis gel agarosa produk PCR, setiap sampel
memperlihatkan pola pita DNA berukuran sama yaitu 0,4 kb sehingga dapat dilakukan
analisis lebih lanjut. Hasil elektroforesis gel agarosa ini juga membuktikan bahwa metode
lisis sel yang dilakukan telah berhasil.
28
Gambar 4.3 Foto elektroforesis gel agarosa hasil reaksi PCR
Sumur 1 merupakan penanda pUC19/Hinf1. Kontrol positif pada sumur 2, dan pitapita sampel yang berukuran 0,4 kb dapat dilihat pada sumur 3(untuk G10) serta
sumur 4 (untuk G18). Sedangkan pada kontrol negatif (sumur 5) tidak terdapat pita
yang menunjukkan tidak adanya kontaminasi pada pelarut yang digunakan.
4.5 Hasil Sekuensing Daerah HVSI Sampel
Fragmen 0,4 kb dari hasil PCR kemudian ditentukan urutannya dengan metode Dideoksi
Sanger. Reaksi sekuensing dilakukan oleh Macrogen menggunakan primer M1 yang
berukuran 20 nukleotida dengan urutan 5`- CACCATTAGCACCCAAACCT-3`. Prinsip
reaksi sekuensing dengan metode Dideoksi Sanger adalah penghentian atau terminasi DNA
polimerase dengan penambahan dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP) yang kehilangan
gugus hidroksi pada karbon 3’ dari gula ribosa. Hilangnya gugus hidroksi ini menyebabkan
DNA polimerase tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester antara dNTP sebelumnya
dengan ddNTP sehingga perpanjangan rantai DNA oleh DNA polimerase terhenti (Sanger et
al., 1977).
Melalui proses sekuensing didapatkan elektroforegram yang menunjukkan urutan nukleotida
masing-masing sampel. Gambar 4.4 merupakan contoh elektroforegram yang didapat dari
sampel G18 dalam penelitian ini. Terlihat adanya puncak-puncak dengan warna yang
berbeda-beda yang masing-masing mewakili satu nukleotida dengan basa yang berbeda.
29
Gambar 4.4 Elektroforegram hasil sekuensing sampel klon G18
Sekuensing klon G18 dilakukan oleh Macrogen, Korea menggunakan primer M1 yang
berukuran 20 nukleotida dengan urutan 5`- CACCATTAGCACCCAAACCT-3`. Kurva
berwarna hijau menunjukkan basa adenin, kurva berwarna biru menunjukkan basa
sitosin, kurva berwarna hitam menunjukkan basa guanin dan kurva berwarna merah
menunjukkan basa timin.
Elektroforegram menunjukkan puncak-puncak dengan warna yang berbeda-beda tergantung
kepada jenis basa. Seringkali terdapat lebih dari satu puncak dengan tinggi puncak yang
berbeda-beda untuk setiap nukleotida. Hal ini disebabkan oleh jumlah molekul DNA
mitokondria yang sangat banyak dalam satu sel. Puncak-puncak kecil menunjukkan
nukleotida minoritas dan puncak tertinggi menunjukkan nukleotida mayoritas. Kurva yang
30
mempunyai warna berbeda-beda ini masing-masing diwakili oleh notasi A, C, T, dan G.
Notasi A melambangkan puncak basa adenin, notasi C melambangkan puncak basa sitosin,
notasi T melambangkan puncak basa timin, dan notasi G melambangkan puncak basa guanin
dengan intensitas yang berbeda-beda.
Adapun urutan nukleotida lengkap dari sampel klon G18 dapat dilihat pada Gambar 4.5.
Urutan Nukleotida Sampel G18
16024
16064
16104
16144
16184
16224
16264
16304
16344
16384
TTCTTTCATG
TGACTCACCC
CTGCCAGCCA
TGACCACCTG
CCCCCCCCCC
CTTCAACTAT
CTCACCCACT
AGCACATAGT
TACAGTCAAA
CAGATA
GGGAAGCAGA
ATCAACAACC
CCATGAATAT
TAGTACATAA
CCATGCTTAC
CACACATCAA
AGGATACCAA
ACATAAAGCC
TCCCTTCTCG
TTTGGGTACC
GCTATGTATT
TGTACAGTAC
AAACCCAATC
AAGCAAGCAC
CTGCAACTCC
CAAACCTACC
ATTTACCGTA
TCCCCATGGA
ACCCAAGTAT
TCGTACATTA
CATAAATACT
CACATCAAAA
AGCAATCAAC
AAAGCCACCC
CACCCTTAAC
CATAGCACAT
TGACCCCCCT
Gambar 4.5 Contoh urutan nukleotida lengkap hasil sekuensing fragmen 0,4 kb mtDNA
manusia
Urutan lengkap klon G18 ini akan dibandingkan terhadap Cambridge Reference
Sequence (CRS), klon GMR lain, serta terhadap campuran klon DNA untuk melihat
adanya fenomena heteroplasmi.
4.6 Analisis Urutan Nukloetida Daerah HVSI Sampel
Analisis urutan daerah HVSI mtDNA manusia dilakukan dengan cara membandingkan
urutan setiap klon terhadap CRS, contoh analisis dapat dilihat pada Gambar 4.6. Sedangkan
untuk melihat adanya fenomena heteroplasmi, hasil sekuensing setiap klon sampel yang
sama dan hasil campuran klon DNA dibandingkan terhadap satu sama lain.
31
16024
16064
16104
16144
16184
16224
16264
16304
16344
16384
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
CRS
G18
TTCTTTCATG
TTCTTTCATG
TGACTCACCC
TGACTCACCC
CTGCCAGCCA
CTGCCAGCCA
TGACCACCTG
TGACCACCTG
CCCCCTCCCC
CCCCCCCCCCCC
TCAACTATCA
TTAACTATCA
CACCCACTAG
CACCCACTAG
TACATAGTAC
CACATAGTAC
CAGTCAAATC
CAGTCAAATC
GATA
GATA
GGGAAGCAGA
GGGAAGCAGA
ATCAACAACC
ATCAACAACC
CCATGAATAT
CCATGAATAT
TAGTACATAA
TAGTACATAA
ATGCTTACAA
ATGCTTACAA
CACATCAACT
CACATCAACT
GATACCAACA
GATACCAACA
ATAAAGCCAT
ATAAAGCCAT
CCTTCTCGTC
CCTTCTCGTC
TTTGGGTACC
TTTGGGTACC
GCTATGTATT
GCTATGTATT
TGTACGGTAC
TGTACAGTAC
AAACCCAATC
AAACCCAATC
GCAAGTACAG
GCAAGCACAG
GCAACTCCAA
GCAACTCCAA
AACCTACCCA
AACCTACCCA
TTACCGTACA
TTACCGTACA
CCCATGGATG
CCCATGGATG
ACCCAAGTAT
ACCCAAGTAT
TCGTACATTA
TCGTACATTA
CATAAATACT
CATAAATACT
CACATCAAAA
CACATCAAAA
CAATCAACCC
CAATCAACCC
AGCCACCCCT
AGCCACCCCT
CCCTTAACAG
CCCTTAACAG
TAGCACATTA
TAGCACATTA
ACCCCCCTCA
ACCCCCCTCA
Gambar 4.6 Contoh analisis perbandingan urutan fragmen 0,4 kb mtDNA manusia terhadap
CRS
Klon G18 memiliki mutasi T16189C dan dua insersi C pada posisi antara 16184 dan
16193 terhadap CRS menyebabkan terbentuknya rangkaian poli-C. Mutasi terhadap
CRS ditunjukkan dengan perubahan warna nukleotida menjadi merah.
Pada posisi antara 16184-16193, standar CRS memiliki urutan yang terdiri atas sembilan C
dan satu T. Mutasi substitusi T menjadi C pada posisi 16189 telah banyak dijumpai dan
dapat membagi populasi menjadi dua bagian, yaitu 83% dan 17%, masing-masing untuk
populasi T dan C. Mutasi ini juga menyebabkan terbentuknya rangkaian poli-C sepanjang
10C. Hasil perbandingan urutan setiap klon sampel GMR (G10 dan G18) terhadap CRS
menunjukkan adanya mutasi T16189C ini. Adanya insersi satu C pada posisi antara 16184
dan 16193 untuk klon G10 serta insersi dua C pada posisi yang sama untuk klon G18
memperpanjang rangkaian poli-C yang terbentuk menjadi 11C dan 12C untuk masingmasingnya, seperti yang terlihat pada tampilan program seqman untuk analisis sampel GMR
yang ditunjukkan oleh Gambar 4.7.
32
Gambar 4.7 Tampilan program seqman untuk analisis sampel GMR
Sampel G10 memiliki panjang rangkaian poli-C yang berbeda dengan G18.
Perbedaan panjang ini ditunjukkan dengan tanda strip (-) pada baris sampel G10.
Sedangkan tanda (-) pada baris CRS (ditunjukkan dengan nama mtDNA full pada
gambar) menunjukkan adanya insersi pada sampel yang dibandingkan terhadapnya.
Perbandingan urutan sampel GMR dengan CRS ditunjukkan pada Tabel 4.3. Hasil
perbandingan urutan antara klon-klon ini menunjukkan adanya heteroplasmi berupa variasi
panjang rangkaian poli-C, yaitu 11C untuk klon G10 dan 12C untuk klon G18 (Tabel 4.3).
16185
16186
16187
16188
16189
16190
16191
16191
16193
Insersi 1
Insersi 2
16184
Tabel 4.3 Perbandingan urutan sampel GMR terhadap CRS dan terhadap satu sama lain
CRS
C
C
C
C
C
T
C
C
C
C
X
X
G10
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
X
G18
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Kedua klon GMR memiliki mutasi T16189C dan insersi pada posisi antara 16184 dan 16193 terhadap
CRS. Jumlah insersi yang berbeda menghasilkan panjang poli-C yang berbeda pula, 11C untuk G10
dan 12C untuk G18. Adanya subpopulasi pada sampel GMR dikenal dengan heteroplasmi. Mutasi
terhadap CRS ditunjukkan dengan warna merah.
Adanya subpopulasi mtDNA pada individu tertentu atau yang dikenal sebagai heteroplasmi
seperti ditunjukkan dua sampel yang dianalisis diduga kuat merupakan penyebab tidak
terbacanya urutan nukleotida setelah rangkaian poli-C melalui direct sequencing. Campuran
subpopulasi yang berbeda diduga menyebabkan detektor sekuensing menerima dua sinyal
33
fluoresens yang juga berbeda pada posisi yang sama. Perbedaan sinyal ini terjadi karena
pergeseran basa akibat perbedaan panjang rangkaian poli-C tadi. Dua sinyal fluoresens yang
berbeda akan terdeteksi pada elektroforegram berupa pita yang tidak tajam, bertumpuk dan
intensitasnya sangat rendah. Kloning dapat mengatasi masalah ini karena setiap klon yang
disekuensing hanya terdiri dari satu populasi mtDNA tertentu saja. Heteroplasmi dapat
terdeteksi karena subpopulasi yang berbeda terdapat dalam jumlah yang proporsional. Jika
salah satu subpopulasi sangat dominan terhadap yang lain, maka diduga heteroplasmi tidak
akan terdeteksi karena sekuensing hanya membaca fragmen yang dominan saja. Untuk
membuktikan lebih lanjut hal ini maka dilakukan sekuensing campuran klon yang mewakili
subpopulasi yang berbeda dengan komposisi yang bervariasi (lihat Gambar 4.8).
T16189C
Insersi 1C → 11C
T16189C
A
Insersi 2C→ 12C
B
C
Gambar 4.8 Contoh urutan nukleotida campuran klon DNA
Hasil pencampuran klon G10 (A) dan klon G18 (B) dengan perbandingan masingmasing 50%, menghasilkan, G1 (C) yang memiliki rangkaian poli-C dengan panjang
11C tetapi urutan nukleotida setelah poli-C tidak menunjukkan puncak yang jelas.
Pada penelitian ini dilakukan pencampuran klon DNA dari sampel G10 yang memiliki poliC dengan panjang 11C dan sampel G18 yang memiliki panjang 12C dalam beberapa
perbandingan, salah satunya dapat dilihat pada Gambar 4.8 untuk sampel G1. Hasil dari
pencampuran ini tetap didapatkan mutasi T16189C dan rangkaian poli-C dengan panjang
11C. Akan tetapi, urutan nukleotida setelah poli-C tidak dapat terbaca ditunjukkan dengan
puncak elektroforegram yang menumpuk.
34
Perbandingan urutan nukleotida antara CRS dengan hasil sekuensing klon G10 dan G18
serta sampel G1, G2, dan G3, bertujuan untuk menganalisis adanya heteroplasmi sebagai
penyebab tidak terbacanya urutan nukleotida daerah HVSI yang memiliki urutan poli-C
(Gambar 4.9).
Gambar 4.9 Tampilan program seqman untuk analisis sampel G1, G2, G3, G10, dan G18
Elektroforegram yang dihasilkan setelah urutan poli-C pada sampel G1, G2, dan G3
tidak menunjukkan puncak yang jelas, berbeda dengan yang terlihat pada sampel G10
dan G18. Oleh karena itu pembacaan urutan nukleotida untuk sampel G1, G2, dan G3
hanya dapat dilakukan sampai urutan sekitar 16200, ditandai dengan warna kuning.
Sampel G1 menghasilkan rangkaian poli-C dengan panjang 11C, sampel G2 menghasilkan
rangkaian poli-C dengan panjang 12C, dan sampel G3 menghasilkan rangkaian poli-C
dengan panjang 11C. Ketiga sampel ini menghasilkan puncak elektroforegram yang
menumpuk dengan intensitas yang rendah setelah urutan poli-C, terlihat dengan banyaknya
notasi N pada urutan nukleotida. Notasi N memiliki arti bahwa terdapat puncak yang tidak
jelas yang disebabkan bertumpuknya beberapa puncak pada satu posisi atau terlalu
rendahnya puncak yang dihasilkan dari nukleotida tersebut sehingga mesin sekuensing tidak
dapat memutuskan notasi nukleotidanya. Hal ini menunjukkan dari campuran klon yang
mewakili subpopulasi yang berbeda menghasilkan dua sinyal fluoresens yang berbeda pula
35
dan akan terdeteksi pada elektroforegram berupa puncak yang tidak jelas sehingga
pembacaan urutan nukleotida pada daerah ini menjadi tidak lengkap. Dengan demikian, dari
hasil yang diperoleh dapat memperkuat hipotesis yang menyebutkan bahwa heteroplasmi
menjadi penyebab pembacaan urutan nukleotida DNA mitokondria manusia yang memiliki
poli-C pada daerah HVSI tidak lengkap.
36