11 Analisa Protein -e-learning XI

ANALISA PR O T E I N
Tujuan
Analisa protein
Menera jumlah kandungan protein dalam bahan
makanan
Menentukan tingkat kualitas protein
Menelaah protein sebagai salah satu bahan kimia
secara biokimiawi, fisiologis, rheologis, enzimatis.
Pemecahan protein  profil asam amino
Analisa Protein


Uji Ninhidrin
Analisa jumlah protein total:

Kjeldahl

Metode Lowry

Metode Biuret

Metode spektrofotometer UV

Metode Turbidimetri

Metode pengecatan

Titrasi formol
Analisa jumlah Protein total
Protein
N (total)
Protein kasar (Crude protein)
= Jumlah protein dihitung berdasarkan
kandungan rata-rata unsur N dalam protein


Tidak semua jenis protein
mengandung  N yang sama
ada senyawa bukan protein yang
mengandung N
(misal: urea, asam nukleat, ammonia, nitrat, nitrit,
asam amino, amida, purin, pirimidin)
Analisa jumlah Protein total
Umumnya dilakukan peneraan empiris (tidak langsung) yakni
melalui penentuan kandungan N dalam bahan
Dikembangkan oleh Kjeldahl
Seharusnya hanya N dari protein saja yang ditentukan  sulit dan
kandungan senyawa lain dalam bahan sedikit.
Hasilnya : protein kasar (crude protein).
Dasar



Protein alamiah  N rata-rata 16%
Jumlah protein = jumlah N X 100/16
= jumlah N X 6,25
Senyawa tertentu sudah diketahui komposisi
 fk (faktor perkalian):
 Protein gandum = 5,70
 Protein susu = 6,38
 Protein gelatin (kolagen yang terlarut) = 5,55
Faktor perkalian (fk) beberapa bahan
Macam Bahan
Faktor perkalian (fk)
Bir, sirup, biji-bijian, ragi
Buah-buahan, the, anggur, malt
Makanan ternak
6,25
Beras
5,95
Roti, gandum, makaroni, mie
5,70
Kacang tanah
5,46
Kedele
5,75
Kenari
5,18
Susu
6,38
Gelatin
5,55
Analisa protein cara Kjeldahl
 3 tahap:



Proses destruksi
Proses destilasi
Proses titrasi
Tahap destruksi

Sampel dipanaskan dalam H2SO4 (p)  terpecah
menjadi unsur-unsurnya :




C  CO dan CO2
H  H2O
N  (NH4)2SO4
Kebutuhan H2SO4 (p)  minimum = 10 ml (18,4 g)



1 g protein  9 g H2SO4
1 g lemak  17,8 g H2SO2
1 g Karbohidrat  7,3 g H2SO4

lemak sebaiknya dihilangkan sebelum destruksi

Sampel = 0,4 – 3,5 g Mikro Kjeldahl = 10 – 30 mg

Destruksi selesai bila larutan jernih/tidak berwarna.
Blanko  koreksi adanya senyawa N dari reagensia

Katalisator proses destruksi


Katalisator  menaikkan
titik didih H2SO4 
mempercepat destruksi
Jenis:

Na2SO4 dan HgO (20 : 1)

K2SO4

CuSO4



Se
Suhu destruksi: 370 – 410oC
1 g K2SO4 dapat menaikkan titik didih 3oC
Reaksi selama destruksi
(bila menggunakan HgO)
HgO + H2SO4
HgSO4 + H2O
2HgSO4
Hg2SO4 + SO2
Hg2SO4 + 2H2SO4
2HgSO4 + 2H2O + SO2
[CHON] + On + H2SO4
CO2 + H2O+ [NH4]2SO4
+
2On
Katalisator proses destruksi

Penggunaan katalisator Hg
o
Amonium sulfat yang terbentuk
dapat bereaksi dengan merkuri
oksida
membentuk
senyawa
kompleks merkuri-amonia
o
Sebelum
destilasi,
Hg
harus
diendapkan terlebih dahulu dg K2S
atau
tiosulfat
agar
senyawa
kompleks merkuri-amonia pecah
menjadi amonium sulfat
Katalisator proses destruksi

Penggunaan katalisator Se
o Tidak perlu diberi perlakuan
sebelum destilasi
o Se lebih reaktif dibandingkan
merkuri dan kuprisulfat
o Kelemahan Se: oksidasi sangat
cepat, sehingga nitrogennya
kemungkinan ikut hilang
o Solusi: penggunaan Se yang
sangat sedikit (< 0,25 g)
Destilasi



Amonium sulfat dipecah menjadi amonia
(NH3 ) dengan penambahan NaOH sampai
alkalis dan dipanaskan
NH3 yang dibebaskan ditangkap oleh
larutan asam standar yaitu HCl/asam borat
4% berlebihan ( indikator BCG + MR atau PP)
 ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam
asam, agar kontak antara asam dan amonia lebih baik

superheating dicegah
dengan Zn.

Destilasi diakhiri bila
semua NH3 sudah
dibebaskan (destilat tidak
bereaksi basis).
Tahap titrasi
Dengan penampung HC
lSisa HCl dititrasi dengan NaOH 0,1 N; indikator PP
sampai merah muda
ml NaOH (blanko – S)
%N =  X N NaOH X 14,008 X 100%
berat sampel (g) X 1000
Dengan penampung asam borat
 Titrasi dengan HCl 0,1N dengan indikator BCG + MR
 Akhir titrasi : biru  merah muda
ml HCl (S – Blanko)
%N =  X N NaOH X 14,008 X 100%
berat sampel (g) X 1000

% Protein = % N X F/K (6,25)
Cara lain
penentuan N


Cara Van Slyke
Cara Dumas
Cara Van Slyke
Protein / asam amino direaksikan dengan
asam nitrit
Gas nitrogen yang terjadi diukur banyaknya
secara volumetris
RNH2 + HNO2  ROH + H2O + N2
1 grol N = 22,4 liter  kadar protein dapat dihitung
Protein
Pirolisis
Cara Dumas
N
Ukur Volume
1 ml Larutan Protein
Ditambah 5 ml Lowry B
Metode Lowry

digojog, dibiarkan 10 menit

Ditambah 0,5 ml Lowry A


digojog, dibiarkan 20 menit

Didiamati OD-nya
pada λ = 600 nm
Protein
dengan
asam
fosfotungstat dalam suasana
alakalis akan berwarna biru
Intensitas
warna
biru
berkorelasi
dengan
kadar
protein
Peneraan pada λ = 600 nm
Kurva standar  menggunakan
protein standar (Bovine Serum
Albumin = BSA)
Metode Lowry 10 – 20 kali
lebih
sensitif dibandingkan
cara UV atau Biuret
Metode Biuret

Menunjukkan
adanya
senyawa-senyawa
yang
mengandung gugus amida asam (- CONH2) yang
berada bersama gugus amida asam yang lain atau
gugus yang lain seperti :



- CSNH2
- CHOHCH2NH2
- C(NH) NH2
- CHOHCH2 NH2
- CH2NH2
- CHNH2CH2OH
- CRHNH2
- CHNH2CHOH
Intensitas warna biru-violet tergantung konsentrasi protein
Pengukuran: pada  = 560 – 580 nm, perlu kurva standar
Hanya protein/senyawa peptida yang bereaksi dengan
biuret kecuali urea  metode ini lebih baik
dibandingkan Kjeldahl
O H
ll l
HOOC-CH-NH-C-C-NH2
l
l
R
R
RH
R
l l
l
NH2-C-C-NH-C-COOH
H l
l
O
H
l
Cu
l
H
OH
l
l l
HOOC-C-NH-C-C-NH2
l
l l
R
HR
Senyawa berwarna biru violet
+
CuSO4
+
NaOH
+ Na2SO4 + H2O
Metode Spektrofotometer UV
Protein (asam amino
tirosin, triptofan, dan
fenilalanin)
mengabsorbsi sinar UV
 Pengukuran

perlu
kurva standar
 Metode ini: cepat, mudah
dan tidak merusak bahan

Metode Turbidimetri




Penambahan bahan pengendap
protein (misal: tri chloro acetic acid
(TCA),
kalium
feri
cyanida
(K4Fe(CN)6),
atau
asam
sulfosalisilat

menyebabkan
kekeruhan dalam larutan yang
mengandung protein
Perlu dibuat tabel atau kurva
hubungan antara kekeruhan dengan
kadar protein
Untuk pentuan kadar protein bahan
yang berupa larutan
Hasil: biasanya kurang tepat
Metode Pengecatan
Bahan pewarna (misal: Orange
G, Orange 12 dan amido black)
dapat membentuk senyawa
berwarna dengan protein dan
menjadi tidak larut
 Sisa bahan pewarna yang tidak
bereaksi dalam larutan diukur
dengan colorimetrer  kadar
protein
dapat
ditentukan
dengan cepat
 Perlu kurva standar

Metode Titrasi Formol
Metode ini hanya tepat untuk
penentuan proses terjadinya
pemecahan protein, dan kurang
tepat untuk penentuan protein.
 Larutan
protein
dinetralkan
dengan NaOH  kemudian
ditambah formalin, sehingga
terbentuk dimetilol
 Indikator: PP
 Titik akhir titrasi: perubahan
warna menjadi merah muda

BAHAN DISKUSI



Kenapa faktor konversi dari kadar N ke kadar
protein tidak sama untuk semua bahan?
Pada saat destilasi dan titrasi, kenapa larutan
untuk menitrasi berbeda jika larutan
penampung yang digunakan berbeda?
Apa yang akan terjadi jika sampel yang
dianalisa terlalu banyak?
TUGAS

Ditimbang 35 mg sampel dan dianalisa
kadar proteinnya dengan mikro
Kjeldahl, Volume HCl 0,02N untuk titrasi
blanko 0,08 ml. titrasi sampel = 7,88
ml.


Jelaskan tahap-tahap dalam analisa tsb
dan apa tanda berakhirnya masing-masing
tahapan
Hitung kadar protein sampel tsb