PENYUSUNAN PUSTAKA DNA GENOMIK

SEMINAR HASIL DOSEN MUDA
PENYUSUNAN PUSTAKA DNA GENOMIK
RHIZOBAKTERI PENGHASIL IAA
OLEH:
LILY SYUKRIANI,SP
FUJI ASTUTI,SSI. MSI
SELVI ELVIA
PEMBIMBING:
PROF.DR.SC.AGR.IR.JAMSARI,MP
PENDAHULUAN
• Kira-kira 25% dari luas daratan Indonesia
mrpk ultisol
• Permasalahan tanah ultisol
hara makro
rendah, hara mikro tinggi
meracuni
tanaman
menghambat pertumbuhan
akar
• Mikroorganisme di dalam tanah dapat
memacu pertumbuhan tanaman
menghasilkan auksin, giberelin, etilen, dll
 Auksin sangat berperan dalam pertumbuhan
dan perkembangan tanaman terutama dalam
perbesaran dan pembelahan sel,
mempengaruhi permeabilitas membran sel,
peningkatan respirasi pada jaringan
tanaman, memacu sintesis mRNA serta
protein enzim berupa protein struktural,
inisiasi pembentukan akar, dll
 Biosintesis auksin tidak hanya pada tanaman
tingkat tinggi tetapi juga pada
mikroorganisme seperti fungi, bakteri,
actinomycetes dan alga.
 Kemampuan rhizobakteri memproduksi IAA
dapat dimanfaatkan untuk peningkatan dan
perbaikan pertumbuhan tanaman melalui
teknologi rekayasa genetika
 Gen yang diperoleh dari pustaka genom
dapat digunakan untuk memproduksi IAA
dalam jumlah besar
 Pustaka DNA mrpk sekumpulan sekuens
DNA dari suatu organisme yang masingmasing telah diklon ke dalam vektor tertentu
untuk memudahkan pemurnian ,
penyimpanan, dan menganalisisnya.
TUJUAN PENELITIAN
 Memperoleh isolat rhizobakteri yang mampu
menghasilkan IAA
 Menyusun pustaka DNA genomik
rhizobakteri penghasil IAA tertinggi
BAHAN DAN METODE
 Penelitian ini dilakukan mulai bulan April
2009 – Januari 2010, di laboratorium
Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Lt II
Jur BDP Faperta Unand
 Penelitian ini terdiri dari 2 tahap :
1. Identifikasi rhizobakteri penghasil IAA
2. Penyusunan pustaka DNA rhizobakteri
penghasil IAA
I. Identifikasi rhizobakteri
 A. Secara fisiologis
 1. Pengambilan sampel tanah
 2. Isolasi rhizobakteri
 3. Uji gram
 4. Uji pigmen fluorescen
 5. Uji kemampuan rhizobakteri dalam
memproduksi IAA
HASIL DAN PEMBAHASAN
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Kode Isolat
Al 1
Al 2
Al 3
Al 4
Al 5
Al 6
Al 7
Al 8
Al 9
Al 10
Al 11
SK 1
SK 2
SK 3
SK 4
SK 5
SK 6
SK 7
SK 8
PR 1
PR 2
PR 3
PR 4
PR 5
PR 6
Asal Tanaman Uji Gram
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Negatif
Positif
Positif
Negatif
Uji Fluorescen
OD
IAA
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
0.113
0.101
0.096
0.276
0.071
0.071
0.132
0.117
0.061
0.336
0.289
0.092
0.303
0.09
0.062
0.065
0.221
0.102
0.079
0.096
0.094
0.156
0.109
0.162
0.123
10.53
9.41
8.94
25.71
6.61
6.61
12.3
10.9
5.68
31.3
26.92
8.57
28.22
8.38
5.78
6.05
20.59
9.5
7.36
8.94
8.76
14.53
10.15
15.09
11.46
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
PR 7
PR 8
PR 9
PR 10
PR 11
PR 12
PR13
PR 14
PR 15
PR 16
PR 17
PM 1
PM 2
PM 3
PM 4
PM 5
PM 6
PM 7
PM 8
KM 1
KM 2
KM 3
KM 4
PT 1
PT 2
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Karamunting
Karamunting
Karamunting
Karamunting
Polysticum sp
Polysticum sp
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
0.142
0.067
0.15
0.057
0.047
0.107
0.099
0.101
0.093
0.099
0.234
0.109
0.135
0.052
0.155
0.1
0.077
0.172
0.108
0.078
0.095
0.13
0.094
0.068
0.082
13.23
6.24
13.97
5.31
4.38
9.97
9.22
9.41
8.66
9.22
21.8
10.15
12.58
4.84
14.44
9.32
7.17
16.02
10.06
7.27
8.85
12.11
8.76
6.33
7.64
• Dari 50 isolat dipilih 6 isolat yang menghasilkan IAA
tertinggi untuk selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan
bakteri sekaligus uji kemampuan rhizobakteri
menghasilkan IAA setiap 4 jam
A
B
S
O
R
B
A
N
WAKTU PENGAMATAN (JAM)
• Grafik 1. Laju pertumbuhan dan kemampuan isolat
menghasilkan IAA,
•
ket : a = isolat Al 10 , b = isolat Al 4, c = isolat PR 17,
d =isolat SK 6, e = isolat SK 2, f = isolat Al 11
 B. Secara molekuler
 Isolat yang menghasilkan IAA tertinggi (Isolat
Al 11) diidentifikasi secara molekuler
 1. Isolasi DNA
 Menggunakan metode Leah, White, Rhoad & Leung
(1994)
M
M = λ DNA 50,
1
1 = DNA isolat Al 11
 2. Amplifikasi gen 16S rRNA
 DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan
kombinasi primer yang didesain dari sekuen gen 16S rRNA.
Kombinasi primer yang digunakan adalah 27F (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) dan 1525R (5’AAGGAGGTGWTCCARCC-3’).
 Reaksi PCR dilakukan pada total volume 25 µl yang terdiri
dari 2 µl DNA templet, 2 µl kombinasi masing-masing primer
27Fdan 1525R (5 pmol/µl), 21 µl ddH2O PCR dalam RTG-PCR
Bead. Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus pada mesin
PCR (Biometra-Jerman).
M
1
1500 bp
M = 1 Kb,
1 = produk PCR
Hasil elektroforesis dari fragmen produk PCR dengan
ukuran sekitar 1500 bp, yang merupakan ukuran yang
diharapkan bila menggunakan kombinasi primer 27F
dan 1525R dari sekuens gen 16S rRNA
• 2. Analisis sekuens gen 16S rRNA
– Sekuensing dilakukan di PT CPI (Chaeron Phokphand
Ind) di Jakarta. Sekuensing dilakukan satu arah (one
read direction) menggunakan primer 1525R, kemudian
diedit menggunakan bantuan paket software
DNASTAR (Madison Wisconsin-USA) dan dikontrol
secara manual.
 C. Analisis BLAST sekuen DNA
 Analisis BLAST dilakukan untuk membandingkan
data sekuens yang dimiliki dengan sekuenssekuens DNA dari berbagai penjuru dunia dan
tanaman yang didepositkan pada database (gen
bank) sekuens publik. Analisis BLAST dilakukan
secara online pada website NCBI (National Centre
of Biotechnology Information)
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
•.
Kode akses
FN563421.1
FN563419.1
GQ487956.1
AY346313.2
EU116047.1
Deskripsi
Acinetobacter genomosp.3 partial 16S rRNA gene,
strain bpoe1350
Acinetobacter genomosp.3 partial 16S rRNA gene,
strain bpoe1348
Uncultured bacterium clone G1041 16S rRNA
gene, partial sequence
Acinetobacter calcoaceticus strain HPC253 16S
rRNA gene, partial sequence
Acinetobacter calcoaceticus strain D9 16S rRNA
gene, partial sequence
Max.
Identifikasi
93%
93%
93%
93%
93%
 Bakteri Acinetobacter calcoaceticus
merupakan bakteri gram negatif, mampu
menghasilkan IAA, siderophor, pelarut
phospat (Prashantt, Makarand, Bhushan,
Sudhir, 2008)
 8 strain Acinetobacter yang di isolasi dari
rhizosfir tanaman gandum mampu
menghasilkan IAA (Huddedar1, Shete, Tilekar,
Gore, Dhavale, Chopade, 2002)
II. Penyusunan Pustaka DNA
 1. Isolasi DNA genomik rhizobakteri
 2. Pemotongan parsial DNA rhizobakteri
 3. Preparasi DNA plasmid
 4. Ligasi fragmen ke dalam vektor
 5. Transformasi vektor ke dalam sel inang
 6. Seleksi koleksi rekombinan
 7. Analisis ukuran insert
2.Penyusunan Pustaka DNA
• 1. Isolasi DNA rhizobakteri
•
konsentrasi DNA cukup tinggi kira-kira 600 ng1000 ng.
M 1 2 3 4
• Gambar 1. Hasil elektroforesis isolasi DNA rhizobakteri ‘G’,
•
M = λ DNA 50, 1-4 = DNA rhizobakteri ‘G’
 2. Pemotongan parsial DNA rhizobakteri
 Penggunaan enzim EcoRI karena kompatibel dengan
plasmid PUC18.
 Menghasilkan pita smear antara 4-10 kb.

M
4.5 u 5 u
5.5 u 6 u 6.5 u 7 u
10000 bp
4000 bp
 Gambar 2. Hasil elektroforesis restriksi menggunakan
enzim EcoRI, M = 1 kb,
• 3. Isolasi dan pemotongan DNA plasmid
PUC 18
• Vektor yang digunakan untuk penyusunan pustaka DNA ini adalah
PUC18 yang berukuran 2686 bp.
• PUC18 ini sebelum dipergunakan perlu diperbanyak terlebih
dahulu di dalam E.coli, setelah itu baru DNA plasmid diisolasi.
•
M
1
Gambar 3. Hasil elektroforesis isolasi DNA PUC18,
M = 1 kb, 1 = DNA PUC18
 4. Ligasi dan transformasi
 Ligasi antara fragmen DNA ‘G’ dengan plasmid PUC18
dilakukan dengan enzim T4 DNA ligase, yang kemudian
langsung ditransformasi menggunakan metode heat
shock, hasil transformasi ini ditumbuhkan pada media LB
padat yang mengandung ampicilin, X-gal dan IPTG.
Gambar 4. Hasil transformasi klon rekombinan ke
dalam E.coli DH5α
Koloni putih = koloni rekombinan = 176 koloni
Koloni biru = non rekombinan = 6 koloni
• 6. Analisis ukuran insert
– Koloni putih yang dihasilkan kemudian diamplifikasi
menggunakan primer M13RF, dengan kondisi PCR
predenaturasi 940C selama 2 menit, denaturasi 940C
selama 1 menit, anneling 550C selama 1 menit, extensi
720C selama 1 menit, final extensi 720C selama 7 menit.
– Amplifikasi ini bertujuan untuk mengetahui berapa
fragmen DNA yang telah terinsert
M
•
•
•
1
2
1000 bp
Gambar 5. Hasil elektroforesis amplifikasi koloni
rekombinan, M = 1 kb, 1-2 = DNA ‘G’
 Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa
setelah diamplifikasi ternyata fragmen DNA
yang terinsert ke dalam vektor adalah
sebesar lebih kurang 1000 bp – 103 bp
(panjang primer M13) = 897 bp
KESIMPULAN
 1. Dari 50 isolat yang diisolasi dari rhizosfir
tanaman ultisol mampu menghasilkan IAA,
Isolat Al 11 merupakan penghasil IAA
tertinggi dari rhizosfir tanaman alang-alang
sebanyak 26,92 ppm
 2. Penyusunan pustaka DNA telah berhasil
dilakukan dengan terinsertnya fragmen
sekitar 897 bp
TERIMA KASIH