Praktikum Biselmol I
advertisement
Praktikum Biselmol I 1. Penentuan Akurasi dan Presisi Mikropipet 2. PCR gen aktin dari zebra fish Mikropipet Teknik Pipeting Akurasi dan Presisi Semakin besar E% ? Semakin besar nilai RSD Pengukuran yang baik jika? 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑢𝑘𝑢𝑟𝑎𝑛 − 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐸% = 𝑥 100 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑅𝑆𝐷 = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑥 100 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑢𝑘𝑢𝑟𝑎𝑛 PCR • Metode amplifikasi DNA in vitro • Amplifikasi DNA spesifik dengan proses replikasi DNA berulang kali • 1 pg DNA dapat diamplifikasi menjadi 0,5 - 1 g DNA • Urutan basa DNA yang akan diamplifikasi perlu diketahui 5 Replikasi DNA: semi-konservatif • • Satu molekul DNA menjadi 2 molekul DNA Masing-masing molekul DNA baru: • • • 1 untai lama 1 untai baru Untai lama menjadi templat bagi untai baru 6 Sintesis DNA • DNA polimerase selalu memerlukan: • • • • DNA templat (cetakan) DNA primer Kofaktor Mg++ Substrat dNTP: • • • • dATP dGTP dCTP dTTP • 3’-OH dari gula bereaksi dengan fosfat dNTP • Pirofosfat dilepas • Arah sintesis DNA selalu dari 5’ ke 3’ Mathews et al. (2000) Electronic study guide for 5-8 7 Replikasi DNA in vitro • Pemisahan kedua rantai DNA dengan • • Alkali Pemanasan • Penyediaan primer • Oligonukleotida yang komplementer dengan templat 8 PCR • Memerlukan • • • • • Templat Sepasang primer DNA polimerase termostabil Mg++ dNTP 9 Templat PCR • Fragmen DNA yang akan diamplifikasi ada pada templat • Urutan DNA yang akan diamplifkasi sudah diketahui • Minimal 1 molekul DNA • Sumber: • Darah, sperma & jaringan lain (yang segar maupun yang sudah lama) • Koloni bakteri, plaque • DNA murni 10 Primer • Panjang 18 - 30 nt • Menentukan fragmen mana yang akan teramplifikasi • Tm = suhu dimana separuh dari rantai DNA sudah terpisah Tm harus sama. Untuk primer < 25 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) • Dapat ditambahkan sisi pengenalan enzim restriksi pada ujung 5’ dari primer • Bila hanya diketahui urutan asam amino dari protein, dapat dibuat primer degenerate 11 DNA polimerase termostabil • Enzim Taq DNA polimerase • Berasal dari Thermus aquaticus • Pada 95oC, t1/2 = 2 jam • Tidak mempunyai aktivitas exonuklease 3’ 5’ (“proofreading”) • akibatnya tingkat kesalahan replikasi DNA relatif tinggi • Pada ujung 3’ ditambahkan dA • Enzim Pfu DNA polimerase • Berasal dari Pyrococcus furiosus • Pada 95oC selama 90 menit, aktivitas masih 90% • Mempunyai aktivitas exonuklease 3’ 5’ (“proofreading”) • Menghasilkan DNA ujung tumpul 12 Proses PCR 95oC, 3 menit Denaturasi awal 95oC, 1 menit Denaturasi 1x 40-65oC, 1-3 menit Penempelan primer 72oC, 1 menit Elongasi 25-35 x 72oC, 3 menit 1x Elongasi akhir Ukuran DNA hasil PCR ditentukan dengan elektroforesis gel agarosa 13
