Teknik PCR- - Fakultas Biologi

TEKMKPCR
oleh
Drs. Agus Hery Susanto, M.S.
staf pengajar Fakultas Biologi Unsoed
Pendahuluan
Teknik PCR (polymerase chain reaction) digunakan untuk menggandakan
fragmen DNA (urutan basa nukleotida) tertentu secara in vitro melalui reaksi polimerisasi
DNA
secara berulang-ulnng selama beberapa siklus reaksi. Teknik yang ditemukan oleh
Kary Mullis pada tahun 1987 ini telah mengalami berbagai macam modifikasi
dan
penggunaannya meliputi ruang lingkup yang begitu luas.
Komponen PCR
Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA
seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul
oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3'-OH bebas yang berflrngsi sebagai
prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase.
DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau
gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence).
Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi
molekul primer.
Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggat yang terdiri atas sekitar 30
basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa
dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA
polimerase yang digunakan harus termostabil karena salatr satu tahap reaksinya adalah
denaturasi untai ganda DNA yang membuhrhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95"C). Salah
satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah
berasal dari bakteri
lag DNA
polimerase, Ymg
termofilik Thermus aquaticus.
bio.unsoed.ac.id
Tahapan PCR
Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat,
penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu
lebih kurang 95'C, 50oC, dan 70'C. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat
dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada khap selaqiutny4
masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang
masing-masing menempel pada untai tunggat DNA templat. Biasanya, kedua primer
tersebut dinamakan primer ma}u (forward primer) dan primer mundur (reverse primer).
Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari
5' DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu
berjalandariujung 5'ke 3'atantberarti dariujung i'l@ 5'untaitemplatnyo). Dengan
tempat penempelannya hingga ujung
jika
demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA
DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan untai
DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi
akan menjadi temptat pada putaran reaksi berikutrnya. Begitu seterusnya hingga pada
putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2"
-
2n.
Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan
jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan
urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifrkasi).
Bisa dibayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada
akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak
220
*2.20 = 1.048576 - 40 =
1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu
untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya
berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saj4 maka
jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup
bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.
bio.unsoed.ac.id
urutan tareet
5'
^.
----Lr
5',
nNe templat
awal berupa DNA untai ganda
(te|'c)
fr"o,urosi
i
5',
5'
primer
ft soil
U*r*oetan
primer maju
5' -t'
)
3' <# primermundur
5'
(Y7o
$r,**isasiprimer
a)
J.
5
Gambar 1. Putaran Pertama PCR
Perancangan Primer
penempelan primer' Sepasang
Tahapan PCR yang paling menentukan adalah
yang akan dipolimerisasi
primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur)
pada kedua ujung fragmen
masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya
atau setidakyang akan diamplifikasi. untuk itu urutan basanya harus komplementer
ujung
memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah
tidaknya
mengetahui dengan pasti urutan
fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum
tertentu untuk merancang urutan
basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara
basa kedua primer yang akan digunakan'
bio.unsoed.ac.id
mempunyai kemiripan
Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga
urutan serupa dari sejumlah
dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah
sebagai contoh,
spesies/strain organisme rainnya yang terah diketahui/dipublikasikan.
dapat mengamplifikasi sebagian gen
untuk merancang sepasang primer yang diharapkan
gen
dapat digunakan informasi urutan basa
lipase pada isolat Bacillustermofilik tertentu
P' mendocina ' dan sebagainya' yang
lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescenso
sebelumnya telah diketahui'
strain tersebut kemudian
urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai
yang memperlihatkan homologi tinggi antara
dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih
daerah testari (conserved area)'
satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan
lestari inilah yang akan menjadi urutan basa
Sebagiadseluruh urutan basa pada daerah
primer.
metalui penjajaran urutan asam
sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan
ini kemudian diturunkan ke urutan basa
amino pada tingkat protein. Urutan asam amino
akan diperoleh lebih dari satu urutan
DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin
disandi oteh lebih dari satu triplet kodon'
basa DNA karena setiap asam amino dapat
yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa
Dengan demikian, urutan basa primer
ini dinamakan primer degenerate'
kemungkinan. Primer dengan urulan basa semacam
penjajaran urutan basa DNA pun dapat
selain itu, primer yang disusun melalui
pun
basa pada daerah lestari di tingkat DNA
merupakan primer degeneratekarena urutan
tidakselamanyamemperlihatkanhomologisempurna(100%).
Urutanbasapasanganprimeryangtelahdisusunkemudiandianalisis
kemungkinan terjadinya primermenggunakan program komputer untuk mengetahui
atau homologi silang (cross-homologt)'
dimer akibat homologi sendiri (setf-homologt)
salah tempel (mispriming)' yaitu
Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya
juga dilakukan untuk mengetahui titik
penempelan primer di luar sekuens target. Analisis
GC-nya. Sepasang primer yang baik
leleh (I,,|) masing-masing primer dan kandungan
harusmempunyaiT.Yw|relatifsamadengankandunganGCyangcukuptlnggi.
bio.unsoed.ac.id
5',
3',
5o
pendek
yang diinginkan
Fgnen
J
5o
3'
--31
5',
J
J
5'
3',
5',
*5'
fragmen pendek
fang diinginkan
3',
Gambar 2. Hasil PCR putaran kedua dan ketiga
Penutup
dalam
Melatui teknik PCR dapat diperoleh sejumtah besar fragmen DNA tertentu
waktu yang relatif singkat. Namun, keberhasilan amplifikasi dengan teknik PCR
yang
ditentukan oleh berbagai faktor terutama kompatibilitas primer oligonukleotida
digrurakan.
Daftar Pustaka
Molecular
Alberts,8., Johnson, A., Lewis, J., Rafr, M., Roberts, K., and walter, P.2007'
Biology of the Cell 5tr Ed. Garland Science, New York'
Ed' oxford
Elliott, W.H. and Elliott, D.c. 2001. Biochemistry and Molecular Biology 2nd
bio.unsoed.ac.id
University Press, Oxford.
Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Sco$, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H.,
and Matsudara.2OOT.Molecular Cell Biology 6m Ed. W.H. Freemarq New York.
Watson, J.D., Baker, T.A., Bell, S.P., Gann, A.A.F., Levine, M., and Losick, R.M. 2007.
Molecular Biology of the Gene 6n Ed. Benjamin cummings, New York.
bio.unsoed.ac.id
t