kel-05-analisisdna


Untuk Uji forensik dimana sampel DNA
yang dimiliki jumlahnya tidak banyak
dan tidak reproducible

Untuk penyelidikan kriminal ataupun
genetika forensik
mtDNA  Adalah DNA manusia yang
ada di mitokondria. Bersifat haploid
dengan sedikit perbedaan pada basa
nitrogen dan panjang molekul yang
relatif identik tiap mt DNA
 Implikasi  Sulit dianalsia

Metode yang lazim untuk uji DNA nukleus
 elektroforesis.
Sayangnya metode ini sulit diterapkan
pada mt DNA. Hal ini akibat perbedaan
yang sedikit sehingga mudah terjadi
overlapping
Denaturing Gradien Gel Electrphoresis
(DGGE)
 Single Strand Conformational
Polymorphism (SSCP)

Sayangnya metode-metode ini
membutuhkan lebih banyak waktu dan
penelitiannya lebih rumit serta sangat
mahal
Cepat, murah, dan murah
 Tidak membutuhkan manipulasi DNA
yang berlebihan

Prinsip kerja  memisahkan campuran
DNA untuk dibuat rangkaiannya.
 Tujuan  Untuk mengetahui tingkat
kecocokan dari dua buah sampel DNA

Sensitivitas DHLPC sangat tinggi 
mendeteksi hingga setiap sequence
yang berbeda ( substitusi, insersi,
delesi,dll)
 Bisa mendeteksi suatu campuran yang
kompleks
 Bisa mengukur dan memurnikan produk
PCR
 Mendeteksi hingga 95 – 100% mutasi
pada DNA.

Dua macam Mt DNA didenaturasi
 Campuran akan dikromatografi dengan
pelarut cair tertentu
 Didalam kolom kromatografi, DNA yang
cocok akan membentuk heteroduplet
 Heterodulpet akan keluar duluan,
setelah itu dianalisa jenisnya.

Campuran dari dua atau lebih DNA
dipanaskan sampai terdenaturasi.
 Dimasukkan dalam kolom DHPLC akan
membentuk homo & heteroduplices
 Homoduplices  menggambarkan
komponen asli dari campuran
 Heteroduplices  cross-hybridization dari
beberapa kontributor yang berbeda ke
campuran.

Saat kondisinya setengah denaturing
dilarutkan ke dalam pelarut nonpolar (
ACETONITRILIE).
 Heteroduplices  kurang stabil  ada 1
atau lebih pasangan basa yang tidak
cocok, sehinga muncul sebagai early
eluting peak pada grafik kromatografi.


Isolasi heteroduplices, kemudian baru
diidentifikasi dengan menggunakan
pembaca rangkaian DNA.
PCR enzym
 Pelarut non polar (asetonitril)

Analisa dilakukan dengan DNA analyzer
untuk melihat kecocokan pasangan
basanya
 Dapat juga dengan melihat yield
heterodupleks untuk analisa semikualitatif persen kecocokan


Kecocokan DNA dari dua buah sampel
berdasarkan pasangan basa
nitrogennya

HPDLC adalah metode analisa DNA
berdasarkan kesamaan pasangan basa,
jadi tidak butuh fragmen besar, Mt DNA
fragmennya kecil
Sampel yang mau diuji:
 Kain yang digunakan manusia
 Darah
 Air liur
 Semen
 Rambut dengan akar (0,5 cm)
Menaruh 10 mikroliter darah ke kapas
steril yang sudah terlebih dahulu
direndam ke dalam air murni (nanopure
water)
 Dibiarkan di udara hingga kering selama
2 jam pada suhu ruangan.
 Simpan pada suhu -200 C.

Diekstraksi menggunakan EZ1 DNA Tissue kit
run on the BioRobot® EZ1 with DNA Forensic
Card (Qiagen Inc., Valencia, CA)
 Setelah diekstraksi, masukkan ke dalam
200μL of TE (10mM Tris, 1mM EDTA),
kemudian dideteksi dengan qRT-PCR, rantai
dari hasil residu yang akan menginterferensi
hasil disingkirkan dngan sentrifugasi dan
dimasukkan ke dalam tabung baru.

Didalam kolom DHPLC, sampel akan
diamplifikasi dengan PCR serta diretensi
oleh asetonitril
 Sampel Dianalisa

Sampel yang berupa potongan kain,
kapas, atau karpet, dimasukkan ke
dalam 190μL of the Qiagen’s proprietary
“G2 Buffer” dan 10μL of proteinase K
solution (600mAU/mL)
 Vortex (diputar) selama 10 detik dan
diinkubasi dengan suhu 56oC selama 15
menit.
 Pindahkan larutan ke tabung 2 mL baru
dimasukkan ke dalam BioRobot® EZ1.


Didalam kolom DHPLC, sampel akan
diamplifikasi dengan PCR serta diretensi
oleh asetonitril
Aditya Rinus:
- Definisi heteroduplices dan Tujuan analisis?
 Khotib Sarbini:
- Kenapa harus menganalisa mtDNA? Apa
itu mitokondria
 Kenny Lischer:
- Apakah bisa menganalisa mt DNA
dengan teknik RHPLC?

Republik Daudy:
- Apa fase gerak yang dipakai pada
analisa DHPLC mtDNA? Sampel DNA
haploid atau diploid
 Nindya Sani:
- Analisa DNA selain sampel darah
bisakah?
 Pak Setiadi:
- Bisakah menguji DNA selain manusia?
Apakah masih perlu menggunakan
elektroforesis?
