draft artikel ilmiah

ARTIKEL ILMIAH
PENYUSUNAN PUSTAKA DNA GENOMIK RHIZOBAKTERI
PENGHASIL IAA
Lily Syukriani*), Fuji Astuti Febria **), Selvi Elvia***)
ABSTRAK
Penelitian dengan judul “ Penyusunan pustaka DNA genomik rhizobakteri penghasil
IAA” telah dilaksanakan dari bulan April sampai dengan November 2009, dengan tujuan
memperoleh isolat-isolat unggul rhizobakteri yang mampu menghasilkan IAA dan menyusun
pustaka DNA genomik rhizobakteri penghasil IAA.
Percobaan ini terdiri dari 2 tahap yakni tahap 1. Karakterisasi dan identifikasi
rhizobakteri terdiri dari pengambilan sampel tanah, isolasi rhizobakteri, uji reaksi gram, uji
kemampuan rhizobakteri dalam memproduksi IAA. Tahap 2. Penyusunan pustaka DNA genomik
terdiri dari isolasi DNA genomik, isolasi DNA plasmid, ligasi fragmen ke dalam vektor,
transformasi vektor ke dalam sel inang, seleksi koleksi rekombinan dan analisis efisiensi
transformasi.
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini adalah dari isolasi rhizobakteri di sekitar kebun
percobaan kampus Unand Limau Manih dengan kondisi tanah ultisol ternyata mampu
menghasilkan IAA. Dan penyusunan pustaka DNA genomik rhizobakteri penghasil IAA telah
berhasil disusun dengan insert sebesar 897 bp.
Kata kunci : rhizobakteri, IAA, pustaka DNA
*) Staf pengajar Fakultas Pertanian Universitas Andalas
**) Staf pengajar Fakultas MIPA Universitas Andalas
***) Mahasiswa Fakultas Pertanian Universitas Andalas
PENDAHULUAN
Rhizobakteria merupakan kelompok bakteri yang hidup dan berkembang di daerah
rizosfer tanaman. Kelompok rhizobakteria ini diketahui dapat merangsang pertumbuhan
tanaman sehingga produksi tanaman dapat meningkat.
Beberapa kelompok bakteri yang dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan produksi
tanaman adalah : (a) Rhizobium (bakteri penambat N2 yang bersimbiosis dengan kacang–
kacangan, (b) Azotobakter, Azospirillum (bakteri penambat N2 yang tidak bersimbiosis dengan
tanaman, (c) Bacillus subtilis, B. polymixa (bakteri penghasil senyawa yang dapat melarutkan
fosfat tanah), (d) Clostridium dan (e) Pseudomonas fluorescens dan P. putia.
Kemampuan rhizobakteri untuk menghasilkan fitohormon, antibiotik dan senyawasenyawa metabolit lainnya, dapat dimanfaatkan untuk perbaikan atau meningkatkan
pertumbuhan dan hasil tanaman melalui teknologi rekayasa genetika.
Salah satu cara yang digunakan untuk mempelajari genom suatu oganisme adalah dengan
menggunakan pendekatan Shot-Gun. Dengan pendekatan ini, DNA total dipotong dengan
menggunakan enzim restriksi. Oleh karena jumlah potongannya sangat banyak maka sulit
untuk mempelajarinya dalam waktu yang bersamaan.
Oleh sebab itu, potongan-potongan
tersebut perlu disimpan terlebih dahulu sebelum mendapat gilirannya untuk dipelajari. Untuk
menyimpan potongan atau fragmen DNA genom digunakan pustaka genom. Pustaka genom
merupakan koleksi berbagai klon bakteri yang berisi plasmid rekombinan maupun koleksi klon
fage yang mengandung DNA rekombinan.
Pustaka genom merupakan kumpulan fragmen DNA yang disisipkan ke sebuah vektor
(plasmid) (Kartiko, 1990). Pustaka genom dilakukan untuk mengambil gen pembawa sifat
spesifik dari organisme dan mempelajari sifat-sifat dasar biologi molekuler, seperti struktur dan
fungsi gen. Gen yang diperoleh dari pustaka genom dapat digunakan untuk memproduksi
senyawa tertentu dalam jumlah besar (Shahib, 1990).
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini telah dilaksanakan mulai bulan April 2009 – November 2009, di
Laboratorium Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP Faperta Unand. Penelitian ini
terdiri dari 2 tahap: Tahap 1. Mengindentifikasi Rhizobakteria terdiri dari pengambilan sampel
tanah di sekitar kebun
percobaan
kampus Unand Limau Manih , isolasi rhizobakteri
menggunakan teknik pengenceran seri, uji reaksi gram dengan meneteskan KOH pada suspensi
bakteri, uji kemampuan rhizobakteri dalam memproduksi IAA menggunakan pereaksi
Salkowsky.
Tahap 2. Penyusunan pustaka DNA genomik terdiri dari isolasi DNA genomik, isolasi
DNA plasmid, ligasi fragmen ke dalam vektor, transformasi vektor ke dalam sel inang, seleksi
koleksi rekombinan dan analisis efisiensi transformasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
I. Identifikasi Rhizobakteri
1. Isolasi rhizobakteri
Pengambilan sampel tanah dilakukan di daerah sekitar kebun percobaan kampus Unand
Limau manih (pada beberapa rhizosfir tanaman spt : alang-alang (Imperata cylindrica),
sikaduduk (Malastoma malabraticum), pakis, paku-pakuan, pimping dan karamunting. Sampel
tanah yang diperoleh diisolasi menggunakan teknik pengenceran seri mulai dari 10-5, 10-6,dan
10-7. Dari keseluruhan sampel telah diperoleh isolat rhizobakteri sebanyak 71 isolat.
2. Uji reaksi gram
Dari 71 isolat telah dilakukan uji gram untuk melihat bakteri tersebut termasuk gram positif
apabila tidak terjadi penggumpalan atau gram negatif bila terjadi terjadi penggumpalan.
Gram positif : 41 isolat,
Gram negatif
: 30 isolat
3. Uji pigmen fluorescen
Dari 30 isolat yang menghasilkan gram negatif tidak satu isolat pun yang menghasilkan
pigmen fluorescen.
4. Uji kemampuan rhizobakteri dalam memproduksi IAA
Uji kemampuan rhizobakteri dalam menghasilkan IAA yang ditunjukkan dari adanya
perubahan warna merah muda pada suspensi rhizobakteri setelah penambahan pereaksi
salkowsky. Absorban dari perubahan warna merah diukur menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 535 nm yang telah disesuaikan dengan konsentrasi standar IAA dapat dilihat
pada tabel di bawah ini :
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Kode isolat bakteri
4a1
4a2
4b2
4c1
4c2
A
a1
a2
a3
a4
a5
a6
a7
a8
B
b1
b2
b3
C
c3
c4
D
d2
d3
d4
d5
d6
E
e1
e3
e4
e5
F
f3
G
H
I
J
K
Knsk
OD
0.113
0.101
0.234
0.092
0.303
0.336
0.109
0.135
0.052
0.155
0.1
0.077
0.172
0.108
0.099
0.096
0.276
0.071
0.221
0.068
0.082
0.102
0.096
0.094
0.156
0.109
0.162
0.13
0.083
0.12
0.125
0.112
0.107
0.09
0.289
0.094
0.099
0.101
0.093
0.079
IAA (ppm)
10.53
9.41
21.80
8.57
28.22
31.30
10.15
12.58
4.84
14.44
9.32
7.17
16.02
10.06
9.22
8.94
25.71
6.61
20.59
6.33
7.64
9.50
8.94
8.76
14.53
10.15
15.09
12.11
7.73
11.18
11.64
10.43
9.97
8.38
26.92
8.76
9.22
9.41
8.66
7.36
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Krkr
Krpr
L
P
ut1
ut10
ut12
ut13
ut14
ut2
ut4
ut5
ut6
ut7
ut8
ut9
0.078
0.123
0.099
0.081
0.071
0.047
0.061
0.062
0.065
0.132
0.142
0.067
0.15
0.117
0.095
0.057
7.27
11.46
9.22
7.55
6.61
4.38
5.68
5.78
6.05
12.30
13.23
6.24
13.97
10.90
8.85
5.31
Dari 56 isolat dipilih 6 isolat yang menghasilkan IAA tertinggi untuk selanjutnya
dilakukan uji pertumbuhan bakteri sekaligus uji kemampuan rhizobakteri menghasilkan
IAA setiap 4 jam.
A
b
s
o
r
b
a
n
Waktu pengamatan (jam)
Grafik 1. Laju pertumbuhan dan kemampuan isolat menghasilkan IAA,
ket : a = isolat a, b = isolat b2, c = isolat 4b2, d =isolat c, e = isolat 4c2, f =
isolat f
Dari grafik dapat terlihat bahwa rhizobakteri no.f menunjukkan grafik tertinggi
dari keseluruhan isolat yang berarti bahwa isolat no.f atau rhizobakteri ‘G’ menghasilkan
IAA paling tinggi diantara isolat yang lainnya.
II. Penyusunan Pustaka DNA
Isolat rhizobakteri ‘G’ yang menghasilkan IAA tertinggi digunakan untuk penelitian tahap
selanjutnya.
1. Isolasi DNA rhizobakteri
Isolasi DNA telah berhasil dilakukan seperti terlihat pada gambar di bawah ini
dengan 4 ulangan, dengan konsentrasi yang cukup tinggi kira-kira 600 ng-1000 ng.
M
1
2
3
4
Gambar 1. Hasil elektroforesis isolasi DNA rhizobakteri ‘G’, M = λ DNA 50,
1-4 = DNA rhizobakteri ‘G’
2. Pemotongan parsial DNA rhizobakteri
Enzim EcoR1 dapat memotong secara parsial 1µg DNA rhizobakteri pada suhu
37 C selama semalaman (over night) sehingga menghasilkan pita smear antara 4-10 kb.
Penggunaan enzim EcoR1 karena kompatibel dengan plasmid PUC18.
0
Pemberian enzim EcoR1 lebih dari 5 unit menyebabkan DNA total terpotongpotong menjadi fagmen yang berukuran lebih besar. Ukuran fragmen DNA yang besar
sangat penting dalam mengkonstruksi pustaka genom (Suharso, 2002).
M
4.5 u
5u
5.5 u
6u
6.5 u
7u
10 kb --7 kb ----5 kb -----
Gambar 2. Hasil elektroforesis restriksi menggunakan enzim EcoR1, M = 1 kb,
3. Isolasi dan pemotongan DNA plasmid PUC 18
Vektor yang digunakan untuk penyusunan pustaka DNA ini adalah PUC18 yang
berukuran 2686 bp. PUC18 ini sebelum dipergunakan perlu diperbanyak terlebih dahulu
di dalam E.coli, setelah itu baru DNA plasmid diisolasi. Pada gambar di bawah
merupakan hasil elektroforesis isolasi DNA plasmid dengan konsentrasi yang cukup
tinggi dengan ukuran kurang dari 3000 bp.
M
1
3000 bp--
Gambar 3. Hasil elektroforesis isolasi DNA PUC18, M = 1 kb, 1 = DNA PUC18
DNA plasmid yang telah diperoleh ini kemudian direstriksi menggunakan enzim
EcoR1 1-2 unit yang kemudian di dephosporilasi menggunakan alkaline phosphatase.
Perlakuan dephosporilasi plasmid PUC18 dimaksudkan untuk menghindari terjadinya
ligasi antar plasmid (self ligation) (Nofiani, Sindumarta, Natalia, 2006).
4. Ligasi dan Transformasi
Ligasi antara fragmen DNA ‘G’ dengan plasmid PUC18 dilakukan dengan enzim
T4 DNA ligase, yang kemudian langsung ditransformasi menggunakan metode heat
shock, hasil transformasi ini ditumbuhkan pada media LB padat yang mengandung
ampicilin, X-gal dan IPTG. Vektor PUC18 membawa gen ampicilin menyebabkan
koloni yang tumbuh bersifat resisten terhadap ampicilin. Penyisipan DNA pada daerah
gen lacZ dapat diseleksi berdasarkan warna koloni yang dihasilkan dengan adanya X-gal
dan IPTG.
Gambar 4. Hasil transformasi klon rekombinan dalam E.coli DH5α
Koloni putih yang dihasilkan kemudian diamplifikasi menggunakan primer
M13RF, dengan kondisi PCR predenaturasi 940C selama 2 menit, denaturasi 940C selama
1 menit, anneling 550C selama 1 menit, extensi 720C selama 1 menit, final extensi 720C
selama 7 menit. Amplifikasi ini bertujuan untuk mengetahui berapa fragmen DNA yang
telah terinsert.
M
1
2
1000 bp-
Gambar 5. Hasil elektroforesis amplifikasi koloni rekombinan, M = 1 kb,
1-2 = DNA ‘G’
Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa setelah diamplifikasi ternyata fragmen
DNA yang terinsert ke dalam vektor adalah sebesar lebih kurang 1000 bp – 103 bp
(panjang primer M13) = 897 bp.
KESIMPULAN DAN SARAN
1. Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilaksanakan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :
a. Dari isolasi rhizobakteri di sekitar kebun percobaan kampus Unand Limau Manih
dengan kondisi tanah ultisol ternyata mampu menghasilkan IAA.
b. Penyusunan pustaka DNA genomik rhizobakteri penghasil IAA telah berhasil disusun
dengan insert sebesar 897 bp.
2. Saran
a. Disarankan untuk melakukan penelitian lanjutan untuk mengisolasi gen penghasil
IAA tersebut.