Uji fotometer

Uji Fotometri
DR. Pingkan Aditiawati
I. Pendahuluan
 Pengujian fotometri antibiotika dilakukan berdasarkan:
(1) pengetahuan interaksi organisme dan inhibitor;
(2) pengukuran fotometri turbiditas (kekeruhan).
 Manfaat  pengukuran turbiditas meningkatkan
keakuratan pengujian.
 Automatisasi diterapkan pada pengujian turbidimetri.
 Pada kuliah ini juga akan dibahas mengenai
penemuan prosedur yang membantu dalam pengujian
dengan cara baru.
II. Kinetika Interaksi Obat dan Mikroba
 Pada bagian ini akan dibahas mengenai:
• Zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan
• Zat kimia penghambat pertumbuhan
Zat Kimia yang Meningkatkan Pertumbuhan
 Interaksi antara zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan dengan
mikroba meningkatkan massa
 Zat kimia yang diperlukan oleh mikroba adalah zat yang tidak dapat disintesis
oleh mikroba tersebut.
 Zat kimia yang ditentukan secara kuantitatif dengan metode mikrobial 
asam amino, vitamin B, kmponen organik, dan mineral.
 Pengujian dilakukan untuk mengetahui  zat kimia yang esensial untuk
pertumbuhan organisme, organisme itu sendiri, dan pengukuran defisiensi zat
kimia tertentu pada medium.
 Pengujian kinetika merupakan pengujian sederhana dan telah dikenal secara
luas  dimana organisme dapat tumbuh jika ada zat kimia (obat), dan
sebaliknya tidak akan tumbuh jika tidak ada zat tersebut.
Waktu inkubasi dan komposisi medium dengan adanya zat kimia pada tabung
hanya merupakan faktor pembatas. Pada keadaan tersebut  jumlah massa
sel proposional dengan jumlah zat kimia dalam tabung,. Pada kondisi ini
merupakan kebutuhan minimum untuk keakuratan pengukuran turbiditas
dalam menguji vitamin.
Zat Kimia Penghambat Pertumbuhan
 Interaksi antara zat kimia penghambat pertumbuhan dengan mikroba
menurunkan produksi.
 Pengujian zat kimia penghambat pertumbuhan dilakukan untuk mengetahui zat
kimia apa yang dapat mengurangi kecepatan pertumbuhan atau memperpanjang
fase lag mikroba, kerentanan organisme terhadap kerja dari zat kimia (obat), uji
fotometri, dan mengetahui respon medium cair terhadap obat.
 Kinetika penghambat pertumbuhan mikroba oleh zat kimia (obat) sangat
kompleks, disebabkan oleh beberapa cara penghambatan: (a) zat kimia
membunuh seluruh bakteri; (b) zat kimia hanya membunuh sebagian populasi;
(c) zat kimia mengurangi kecepatan pertumbuhan populasi secara bersamaan
/serentak; (d) zat kimia mengurangi kecepatan pertumbuhan dengan cara yang
tidak bersamaan; (e) zat kimia memperpanjang periode lag; (f) beberapa
kombinasi yang telah diuraikan diatas.
 Salah satu cara yang telah banyak dipelajari mengenai interaksi mikroba dengan
zat kimia (obat) adalah dengan cara menghitung jumlah bakteri sebagai fungsi dari
waktu dan konsentrasi antibiotik.
III. Penyebaran Cahaya oleh Mikroorganisme
 Cahaya akan disebar oleh partikel koloid, seperti suspensi bakteri.
 Distribusi sudut penyebaran cahaya oleh partikel berbentuk bola, kira-kira sama
dengan ukuran panjang gelombang cahaya.
 Distribusi penyebaran cahaya berbeda-beda untuk setiap organisme.
 Pengukuran distribusi penyebaran cahaya dapat digunakan untuk menentukan
ukuran partikel dan mengidentifikasi bakteri tertentu.
 Manfaat distribusi sudut penyebaran cahaya untuk analisis mikrobiologi pengukuran
transmitan pada sistem fotometri. Dimana kekeruhan suatu suspensi meningkatkan,
makan panjang gelombang cahaya menurun.
 Struktur bagian dalam sel bakteri sangat kompleks, jika terjadi perubahan struktur
maka akan merubah penyebaran cahaya.
 Peningkatan ukuran bakteri berbentuk bola selama siklus pertumbuhan akan merubah
absorbansi suspensi secara proporsional.
 Kesimpulan: absorbansi  mengukur total massa atau volume
IV. Pengukuran Turbiditas (kekeruhan)
Pada bagian ini akan dijelaskan mengenai
Peralatan
Aplikasi
Kalibrasi peralatan
Peralatan






Fotometer digunakan untuk mengukur turbiditas suspensi bakteri.
Fotometer jika digunakan dengan kurva kalibrasi yang diperoleh dari pertumbuhan suatu
organisme, maka dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi organsime yang sama.
Garis kalibrasi akan berbentuk kurva pada konsentrasi yang tinggi  berasal dari hukum
Beer.
Kekeruhan dihitung berdasarkan Hukum Beer:
I/Io= exp (-N Eab), dimana:
N= konsentrasi bakteri; E= koefisien partikel; a= area efektif partikel secara optis;
b= kekeruhan suspensi.
Log Io/I = A=OD=N Eab/2,3
Pada suspensi yang diencerkan, a dan E adalah konstan. Pada fotometer, b= ketebalan
cuvette (juga konstan), sehingga persamaan dapat ditulis :
log Io/I = A = OD = DN ( persamaan yang umum digunakan dalam mikrobiologi), dimana:
A=absorbasni; D=konstan; OD= optical density
Keakuratan pengukuran turbiditas diperlukan untuk memperoleh metode turbidimetri yang
potensial dalam pengujian mikrobiologi, sehingga diperlukan peralatan yang stabil.
Aplikasi
Manfaat menggunakan alat pengukur turbiditas adalah:
(1) menentukan ukuran rata-rata bakteri dari
pengukuran yang tidak simetri
(2) menghitung konsentrasi bakteri untuk mempelajari
pertumbuhan dan pengujian.
 Turbiditas diukur dengan metode fotometri 
absorbansi suspensi

Kalibrasi Peralatan
~
~
~
~
Turbiditas suspensi bakteri menentukan dalam pengujian secara mikrobiologi  diukur
dengan fotometer.
Hubungan antara pembacaan skala dengan konsentrasi suspensi bakteri  nonlinier, diatas
kisaran konsentrasi.
Penggunaan spektrofotometer yang stabil dan voltmeter digital untuk mengukur output
spektrofotometer akan meningkatkan keakuratan pengukuran.
Semakin akurat pengukuran akan menunjukkan kurva kalibrasi peralatan sedikit berbeda
untuk organisme yang berbeda, selain itu warna organisme mempengaruhi bentuk dari kurva
METODE GRAFIK
~ Hubungan antara turbiditas dengan konsentrasi organisme: OD=AN – BN2, dimana A dan B
karakteristik konstanta pada alat pengukur, dan 100 N adalah konsentrasi (biasanya tidak
diketahui) organisme yang mengukur 10,0% T / transmitan (OD=1,00) pada panjang
gelombang yang spesifik.
~ Definisi N (konsentrasi bakteri)  berubah-ubah, secara jelas N dapat ditetapkan dengan
cara lain.
~ Alat pengukur menunjukkan turbiditas dalam OD, %T, atau voltase, sehingga N:
N={A [A2 - 4B(OD)}1/2}/ 2B = {A - [A2-8B+4B log T]1/2}/2B
~
~
~
~
~
~
~
Plot OD terhadap N berupa garis lurus
dengan mempertahankan A dan kemiringan
B. (Lihat Gmbar disamping)
Nilai N (respon terhadap alat), tergantumg
pada opacity, ukuran, bentuk, dan warna
organisme.
Opacity berkorelasi dengan kandungan sel.
Opacity sel hidup berbeda dengan sel yang
mati.
Koefisien A dan B berbeda untuk panjang
gelombang yang berbeda. BN2 menunjukkan
resultan cahaya yang hilang oleh banyaknya
penyebaran cahaya.
Nilai A akan meningkat dengan menurunnya
panjang gelombang cahaya.
OD dengan konsentrasi bakteri 100N akan
sama dengan 100 A jika B=0.
Panjang gelombang yang biasa digunakan
adalah 550-650nm.
~ Contoh kurva kalibrasi pada
beberapa organisme (lihat
gambar disamping).
~ Kurva digunakan untuk
mengubah pengukuran turbiditas
menjadi jumlah bakteri yang
proporsional pada konsentrasi
bakteri.
Perhitungan N
~ Antibiotik dan vitamin menyebabkan respon yang sensitif.
~ Respon ditunjukkan dengan perubahan dalam konsentrasi organisme.
~ Untuk kalibrasi diasumsikan N adalah konsentrasi bakteri (pengukuran N lebih
mengukur massa daripada jumlah)
~ Nilai N sebagai fungsi dari konsentrasi zat kimia/obat yang aktif lebih berarti
daripada % T atau OD sebagai variabel dependent.
~ Hubungan antara N dan OD dapat ditulis dalam persamaan berikut:
N = (OD)+ (OD)
V. Garis Dosis-Respon
Pendahuluan
 Garis dosis-respon merupakan bagian fundamental dalam pengujian mikrobiologi.
 Garis dosis respons  hubungan antara respons organisme dan konsentrasi zat
kimia aktif.
 3 jenis garis dosis respons yang umum digunakan
- uji difusi
- uji turbidimetri zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan, seperti vitamin
- uji turbidimetri zat kimia yang menghambat pertumbuhan, seperti antibiotika dan
desinfektan
 Pada bagian ini juga akan dibahas mengenai:
- Pengukuran pertumbuhan
- Zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan
- Zat kimia yang menghambat pertumbuhan
- Uji garis dosis-respons
Pengukuran pertumbuhan
 Pengukuran pertumbuhan dibuat sebelum garis dosis respon dibuat 
berdasarkan konsentrasi bakteri yang berasal dari pengukuran
turbiditas/kekeruhan
 Pengukuran turbiditas  jumlah konsentrasi bakteri yang proporsional.
 Nilai absolut konsentrasi bakteri tidak ditambahkan dalam pemembuatan garis
dosis respons, konsentrasi bakteri diberikan dalam unit relatif.
 Suatu unit yang tepat menunjukkan nilai 100 pada konsentrasi 10 % T atau
OD= 1,00
 Konsentrasi organisme absolut  OD 1,00 merupakan fungsi dari gelombang
cahaya, kedalaman optik terhadap cuvette, ukuran dan warna organisme, dan
geometri alat
 Kurva oleh 1 organisme (misal S. aureu) tidak digunakan untu mengkonversi
pengukuran organisme lain untuk unit konsentrasi relatif, jika diperlukan
keakuratan.
Zat Kimia yang Meningkatkan Pertumbuhan
¤ Zat kimia yang diperlukan untuk meningkatkan pertumbuhan mikroorgansime diuji
untuk metode mikrobiologi.
¤ Pengujian terhadap asam amino dan vitamin dilakukan dalam skala besar.
¤ Seringkali metode mikrobiologi lebih spesifik, sensitif dan lebih mudah ditampilkan
daripada metode kimia.
¤ Organisme uji  beberapa bakteri asam laktat
¤ Meskipun organisme uji memiliki kebutuhan absolut terhadap vitamin, tetapi total
pertumbuhan organisme tergantung pada nutrisi esensial lainnya, seperti vitamin yang
akan diuji.
¤ Komposisi medium, kosentrasi vitamin dan kondisi pertumbuhan  ditentukan, sehingga
total pertumbuhan dibatasi oleh vitamin (berarti respon suatu sistem terbatas hanya pada
1 variabel)
¤ Garis dosis respon untuk uji vitamin dan asam amino adalah:
N= A + BC, dimana
N = konsentrasi bakteri
C = konsentrasi zat kimia essensial untuk pertumbuhan
¤ Jika medium tidak terkontaminasi dan mengandung zat kimia yang akan diuji, maka A =
0, dan B adalah kemiringan garis
¤ Tiga jenis kurva yang menggambarkan
garis dosis respons, dapat dilihat pada
gambar disamping:
- Garis No.1 kurva ideal, medium
bebas kontaminasi, dengan vitamin B12
dan teknik yang baik
-Garis No.2  menunjukkan adanya
kontaminasi, dengan sedikit vitamin
B12, tetapi memberikan hasil yang
memuaskan
-Garis No.3  menunjukkan
kekurangan vitamin, uji ini tidak dapat
digunakan.
Zat Kimia yang Menghambat Pertumbuhan





Antibakteri diuji dengan mengukur respon pertumbuhan
bakteri yang rentan terhadap antibakteri.
Dua parameter pertumbuhan bakteri yang dipengaruhi oleh
antibakteri adalah kecepatan pertumbuhan dan fase lag.
Pada bekteri yang mati kecepatan pertumbuhan bakteri = 0
dan periode lag tidak terbatas.
Antibiotikmengurangi kecepatan pertumbuhan bakteri.
Zat kimia penghambat pertumbuhan akan membunuh
organisme uji  memperlama fase lag dan mengurangi
kecepatan pertumbuhan
 Di bawah ini beberapa asumsi yang dibuat untuk membuat suatu persamaan
matematik
1. Perubahan suhu inkubasi dan komposisi medium terjadi selama inkubasi.
2.Keadaan /kondisi inkubasi  identik untuk seluruh tabung uji
3.Seluruh bakteri yang tumbuh dalam tabung masih dalam fase log saat inkubasi
berakhir.
4.Periode lag dan konsentrasi zat kimia aktif  berkorelasi dengan:
L = L0 + aC, dimana
L0 = periode lag dengan tidak ada zat kimia aktif
a = konstanta
C = konsentrasi zat kimia penghambat
5.Waktu generasi konstan (konstanta kecepatan pertumbuhan k)  konstan
sepanjang periode inkubasi untuk nilai C tertentu.
6.Kecepatan pertumbuhan konstan (k)  fungsi linear dari konsentrasi zat
kimia penghambat pertumbuhan pada saat zat kimia mempengaruhi kecepatan
pertumbuhan (kecuali sulfonamid)
k = k0 - kaC, dimana
k0 = kecepatan tanpa konsentrasi zat kimia
C dan ka koefisien penghambat
7. Zat kimia tidak dikonsumsi oleh organisme uji
8. Peningkatan jumlah bakteri yang tumbuh dalam waktu tertentu ( t ), tanpa zat
kimia penghambat, ditunjukkan dengan persamaan berikut:
N = N0 exp k (t-L), dimana
N0 = jumlah awal sel
N = jumlah sel setelah waktu inkubasi t
Substitusi untuk nilai k dan L maka persamaan diatas menjadi:
N = N0 exp (k0-kaC)[t- (L0 + aC)]
atau
log N = 0,4343 (k0-kaC)[t- (L0 + aC)] + log N0
Penghambat pertumbuhan secara bersamaan (uniform)

Zat aktif yang menurunkan kecepatan pertumbuhan
4 respons berbeda yang disebabkan inokulum atau kondisi zat kimia aktif yang
mempengaruhi atau tidak mempengaruhi fase lag
1. Antibakteri tidak berpengaruh pada periode lag, sehingga a = 0. Inokulum dalam
fase log, L0 = 0. Maka persamaan dapat ditulis sebagai berikut:
log N = 0,4343 (k0-kaC)[t- (L0 + aC)] + log N0
persamaan diatas menunjukkan garis dosis-respons untuk penicilin, eritromisin,
tylosin,kloramfenikol dan tetrasiklin .Persamaan diatas juga dapat ditulis dalam bentuk
uji dosis-respon:
log N = A – BC, saat waktu inkubasi konstan seperti pada uji antibiotika umumnya,
dimana,
A = 0,4343 k0t + log N0
B = 0,4343 kat
2. Zat kimia aktif menyebabkan periode lag, dimana a > 0. Inokulum berada dalam
periode log, maka L0 = 0, sehingga diperole persamaan:
log N = 0,4343 (k0-kaC)(t- aC) + log N0
Pada saat t konstan dalam suatu uji maka:
log N = A-BC + 0,4343 (k0aC2-k0aC)
Plot dari log N terhadap C bukan merupakan gari lurus, melainkan berbentuk kurva.
Gambar dibawah ini menunjukkan garis
C>0 dengan kemiringan garis k0-kaC
Gambar dibawah ini menunjukkan garis
untuk nilai C>0
Gambar yang menunjukkan garis dosis-respons yang tepat untuk
pengujian
3. Zat kimia aktif yang tidak bekerja saat periode lag, dimana a = 0. Inokulum berada pada periode lag,
maka L0 >0
log N = 0,4343 (k0-kaC)(t- L0 ) + log N
log N = A-BC + 0,4343 (k0-kaC) L0
4. Zat kimia yang meningkatkan periode lag, sehingga a >0.Inokulum berada dalam periode lag, dimana
L0 >0.
log N = 0,4343 (k0-kaC)[t- (L0+aC ) + log N
log N = A-BC - 0,4343 (k0-kaC) (L0+aC)
5. Penghambatan sulfonamid terhadap E. coli berbeda dari sistem yang lainnya. Kecepatan
pertumbuhannya konstan, k bukan merupakan fungsi linier dari konsentrasi zat kimia (obat),
melainkan:
k = k0 – C/( + C)
dimana  = 1/ka dan  dan  konstan untuk sulfonamid dan sistem uji. Kerja obat diperlambat
dalam suatu waktu (K), yang konstan untuk setiap suhu inkubasi dan tidak tergantung pada
konsentrasi obat. Pengujian pengaruh K dimulai pada saat t-K dengan inokulum
log Nk = 0,4343k0K + log N0, sebagai pengganti log N0 pada t = 0.
Pada saat inokulum berda pada fase log, persamaan pertumbuhan menjadi:
log N = 0,4343[(k0-C/( + C)](t-k) + 0,4343k0K +log N0
atau
log N = 0,4343k0t-0,4343[C/( + C)](t-k) + log N0
k = 0 saat C = 0 tidak menghambat pertumbuhan dihitung dari
log N = 0,4343k0t+ log N0
 Zat kimia aktif yang mempengaruhi periode lag, dimana ka = 0
1. Inokulum berada dalam fase lag, dimana L0 = 0. Maka diperoleh persamaan:
log N = 0,4343 (k0)(t-aC)+ log N0
atau
log N = A – 0,4343 k0aC
2. Inokulum berada dalam fase lag, dimana L0 > 0. Maka diperoleh persamaan:
log N = 0,4343 (k0)[t – (L0 + aC)] + log N0
atau
log N = A – 0,4343 k0 [L0 + aC] untuk waktu yang tetap
Penghambat Pertumbuhan Nonuniform
Terdapat 4 kategori untuk tiap perlakuan
1. Populasi memiliki 2 kelas kecepatan pertumbuhan, yaitu 0 dan
tidak terhambat.
2. Seluruh sel dipengaruhi oleh derajat yang berbeda, sehingga
kecepatan pertumbuhan tiap individu sel bervariasi.
3. Fase lag seluruh sel dipengaruhi oleh derajat yang berbeda
4. Kombinasi 2 dan 3
•
Kasus 1 menunjukkan all or none situation. Keadaan dimana sel tumbuh pada
kecapatan normal untuk medium dan suhu atau tidak tumbuh sama sekali.
Set  = fraksi sel yang tidak tumbuh
1-  = fraksi sel yang tumbuh pada kecepatan normal
Persamaan pertumbuhan menjadi :
N = N0 ( 1-) exp [k ( t – L) +  N0
Untuk mengeneralisasikan set  = f ( C ), maka
N = N0 [1-f C] exp [k (t- L)] + f (C) N0
Untuk waktu yang tetap dalam pengujian, dimana exp [k (t – L)] = a, konstanta = A.
maka:
N/N0= A[1- f ( c )] + f (c) = A + f ( c )[1 – A]
A adalah suatu konstanta, 1 – A adalah konstanta untuk waktu.
Grafik N/N0 terhadap C akan dalam bentuk f ( c ).
Semakin besar , semakin kecil inokulum yang efektif dan semakin lama waktu
inkubasi yang diperlukan untuk mencapai konsentrasi sel standar.
Persamaan umum untuk menggambarkan keempat kategori penghambatan
yang non-uniform pada pertumbuhan dapat ditentukan. Kategori 2 dan 3
adalah kasus khusus untuk kategori 4.
 Asumsi yang sama L = L0 + aC dan k = k0 – kaC
Penyederhanaan asumsi yang dibuat  adanya jumlah terbatas kecepatan
pertumbuhan dan periode lag. Jika tiap-tiap sel memiliki kecepatan
pertumbuhan dan periode lag yang berbeda dengan yang lain pada
populasi, maka jumlah akan terbatas, meskipun besar.
 Asumsi selanjutnya yang dibuat  beberapa (n) subpopulasi yang terpisah
satu sama lain dapat dibedakan dan seluruh sel dalam subpopulasi
mempunyai kecepatan pertumbuhan dan waktu lag yang sama. Ini dapat
diasumsikan dengan memilih cukup subpopulasi kecil atau dengan
memberikan batasan yang cukup luas untuk parameter.
 Inokulum N0 terdiri dari n subpopulsi masing-masing mengandung N0, cell
pada saat ke-I pada n subpopulasi. Ukuran populasi setelah inkubasi waktu
ke-t dapat digambarkan sbb:
Perumusan pada persamaan 21 adalah jumlah dari 4
kompenen, yaitu:
1. Yang diakibatkan oleh seluruh parameter yang sama
2. Perbedaan antara a dan ai
3. Perbedaan antara ka dan kai
4. Kedua set yang berbeda
•
Kasus 2  identik dengan kasus 4 (persamaan 22) saat fase lag sama pada
seluruh sel (a1 = a untuk seluruh i)
•
Kasus 3  kategori yang terdiri dari sistem dengan variasi periode lag yang
sangat luas.
Seluruh kelompok diasumsikan memiliki kecepatan pertumbuhan sama kai =
ka untuk seluruh i
Pengujian Garis Dosis-Response
 Uji kekeruhan/turbidimetri dikerjakan dengan sangat presisi dengan peralatan
yang automatis  kesalahan kecil
 Interpolasi dari kurva standar biasa  sulit untuk dikerjakan dangan sedikit
kesalahan dari beberapa % kemampuannya . Dari kurva dosis respons harus
dipilih seminimal mungkin kesalahan interpolasi.
 Gambaran singkatnya, alat digunakan dalam menentukan ilustrasi data 
dengan memplot garis dosis respon.
 Turdibiditas diukur dengan alat ukur spektrofotometer dengan panjang
gelombang 550 nm.
 Untuk uji vitamin dibuat grafik OD terhadap C atau N terhadap C.
 Grafik hubungan N terhadap C  lebih baik digunakan untuk mempelajari
permasalahan yang dihadapi dalam pengujian.
 Interpolasi dari garis log OD terhadap C lebih akurat untuk pengujian.
 Untuk pengujian antobiotik, gunakan grafik yang menghasilkan garis lurus dan
kemiringan yang terbaik  saat respons alat tergantung pada variabel
 Plot log-probability antibiotik yang berhubungan saat diuji pada sistem yang
sama memiliki kemiringan yang sama, tetapi dengan MR yang berbeda (MR =
ordinate intercept of a 50 % end point) antibiotik yang tidak berhubungan
biasanya memiliki kemiringan yang berbeda
 Perubahan pH medium uji biasanya mempengaruhi MR bukan kemiringan
garis
 Plot log –probability  untuk mempelajari secara detail pengujian, dengan
membandingkan strain organisme yang sensitif dan membandingkan
sensitivitas (MR) organisme lain terhadap antibiotik.
 Beberapa metode kerja uji turbidimetri terhadap antibiotik  membuat
konsentrasi kurva standar pada skala logaritmik. Hasil kurva standar diplot
sebagai logaritma OD terhadap konsentrasi antibiotik
 Desain diuji dengan menggunakan sistem AUTOTURB untuk menguji
eritromisin. Lihat tabel berikut ini:
VI. Uji Kesalahan
Uji kesalahan berasal dari banyak sebab:
1.Sumber kesalahan pertama adalah pertimbangan terhadap standard and sampel.
Kesalahan biasanya 0,2% atau lebih kecil dari 0,2%, tetapi dapat mencapai 1% atau
lebih pada saat sampel sangat sedikit dan tidak tepat. Pertimbangan
kesalahan seharusnya kurang dari 0,5 % jika > 100 mg.
2.Kesalahan pada pengenceran standard dan sampel untuk pengujian konsentrasi.
Jika menggunakan 1 ml pipet volumetrik dan 100 ml volumetrik flash kesalahan
pengenceran 1 %.
3.Penggunaan pipet yang lebih besar akan mengurangi kesalahan.
Kesalahan dalam pengukuran volume sampel dan inkubasi  kesalahan kurang
dari 0,1 %. Kesalahan tangan pada saat pemipetan volume sampel dapat lebih
besar
4. Kesalahan pada saat inkubasi
5. Kesalahan saat mengakhiri pertumbuhan organisme dan mempersiapkan
suspensi untuk pengukuran turbiditas Pertumbuhan seluruh organisme
pada seluruh tabung uji harus diakhir pada saat yang sama, meski hanya
berbeda 1 menit akan menyebabkan kesalahan.
6. Kesalahan dalam pengukuran kekeruhan dengan metode fotometer
7. Kesalahan dalam interpolasi dari kurva standar
Keakuratan/Presisi
Prosedur statistik terbaik akan membuat uji ke-2 tidak tergantung
pada uji pertama, pada saat mengerjakannya pada hari ke-2.
Uji turbidimetri terdiri dari 6 urutan pengerjaan sebagai berikut :
1. Sampling dan pertimbangan
2. Pengenalan pada tahap pengujian
3. Pengukuran volume sampel dan medium cair
4. Inkubasi
5. Pengukuran turbiditas
6. Interpolasi dari kurva standar dan menghitung
kemampuan/daya dari sampel tersebut
Kontrol Sampel dan Keakuratan
•
•
•
•
•
•
•
•
Biasanya “kontrol” sampel sangat tidak murni.
Selang kepercayaan 95% dibuat tidak berubah pada beberapa uji  Jika uji satu
sampel pada uji hasilnya tidak baik, maka seluruhnya akan tidak baik.
Uji yang tidak baik dapat disebabkan oleh pengerjaan yang tidak baik (seperti
kesalahan dalam pemipetan)
Keakuratan uji diukur dengan perbedaan antara menetukan jawaban dan jawaban
yang benar.
Jawaban benar suatu standar diketahui saat 1 dari beberapa elemen dari kurva
standar menggunakan metode yang akurat.
Metode uji harus memiliki nilai  harus menentukan perlakuan standar sebagai
sampel dengan keakuratan yang dapat diterima .
Dapat diterima  masing-masing metode ditentukan oleh analis
Metode uji untuk antibiotika dalam makanan diterima jika jawaban + 20 % dari nilai
standar sebenarnya.
Metode yang digunakan untuk mengontrol grade pahrmaceutical produk akan
disebut akurat jika dapat mengukur standar +3 % dari nilai yang diketahui
VII. Automatisasi
•
Discrete System
Sekarang ini semakin luas melakukan uji kimia secara automatisas.
Beberapa perusahaan  memproduksi peralatan khusus:
1.Pfizer. Salah satu sistem automatis yang terkenal  Chas. Pfizer & Co,
yaitu mesin yang besar dan kompleks memproses sampel dengan
kecepatan 60 sampel/jam.
2.Abbott. Mesin automatis untuk uji mikrobiologi  seluruh fermentasi
beer dan juga untuk uji turbidimetri erithromycin.
3.Lilly. AUTOTURB, yaitu suatu sistem untuk mengukur sampel, alat ini
mudah digunakan, sederhana, biaya rendah, efisien dan akurat.
4.Upjohn. Automatisasi sistem untuk mambaca hasil uji fotometer
5. Lain-lain  Gulandi and Morisi menciptakan peralatan yang dapat
digunakan untuk mendeterminasi fotometer dan uji mikrobiologi.
• Continuous Flow Systems
 Prosedur aliran continuous menggunakan komponen sistem Auto- Analyzer
untuk menguji antibiotik. Dua prosedur pengerjaannya adalah turbidimeter
dan respirometer
 Pengujian dengan analyzer sangat baik diguankan pada sampel yang sangat
murni mengontrol pembentukan dosis antibiotika
 Lebih ekonomis daripada uji difusi
 Pengujian dengan metode turbidimetri, memerlukan peralatan yang kompleks,
waktu yang panjang untuk start-off, dan pengerjaan harus hati-hati, serta
memerlukan teknisi yang terlatih
VIII. Desain Uji Antibiotik

Pendahuluan
Diperlukan 2 jenis pengujian
1. Keakuratan pengujian untuk mengukur kuantitas zat kimia dalam penyediaan
komposisi awal zat kimia/obat yang murni. Uji harus akurat  karena kesalahan
menyebabkan peningkatan biaya. Uji ini dilakukan untuk mengontrol pembentukan dosis.
2. Uji harus sangat sensitif  untuk dapat mengukur konsentrasi zat kimia/obat dalam
ukuran kecil pada berbagai materi biologi yang jumlahnya besar. Uji ini biasanya
digunakan untuk mengukur antibiotik dalam serum, urin dan pakan ternak.

Uji yang baik memerlukan desain dan kerja yang baik

Desain termasuk dalam pemilihan organisme uji, komposisi dan preparasi medium,
inokulum, waktu dan suhu inkubasi, konsentrasi zat kimia, pH medium, respons,
dan bantuan mekanis

Pengerjaan  aktivitas, pelatihan, motivasi, pekerja (yang tidak dikerjakan oleh
mesin secara otomatis)
Kecakapan
1.Pembuatan uji yang baru  memerlukan tenaga ahli, peralatan dan tempat.

Tim pengembangan produk terdiri dari seorang peneliti senior dan 1-3 asisten
Laboraturium.

Peralatan yang diperlukan sistem autoturb (atau sejenisnya)  untuk uji
Fotometer.

Tempat yang cukup untuk alat dan pekerja (ruang tertutup, tidak membuat keributan, dll).
2.Pengujian rutin

Peralatan minimum untuk uji fotometer, yang akan memproses 60 sampel dan
memerlukan standard. Kapasitas untuk uji dengan cawan petri  48 sampel dan
memerlukan standard.

Pengembangan pengujian rutin harus dikerjakan oleh orang yang berbeda.

Supervisor memonitor pekerjaan dan menjawab penyimpangan yang terjadi, sehingga
kualitas pekerjaan dengan standar, hasilnya akan baik.

Pada pengujian rutin  pekerja harus menentukan jawaban yang benar jika terjadi
penyimpangan.

Jangan mengerjakan seorang yang sering memodifikasi pekerjaan tanpa mengerti akibat
yang ditimbulkan oleh modifikasi tersebut terhadap pengujian.
Penelitian Pendahuluan
 Suatu uji antibiotika yang baru harus melalui beberapa tahapan pengujian sebelum
uji yang akurat dilakukan
 Uji yang pertama adalah: streak plate, serangkaian pengenceran atau metode discplate dengan menggunakan preparasi kering sebagai petunjuk standar.
 Setelah produk hampir murni dan masing-masing tahapan pemurnian tidak
merpengaruhi kemurnian  keakuratan uji harus ditingkatkan untuk mengukur
kemajuannya.
 Uji fotometri atau uji difusi yang akurat diperlukan dan juga setelah antibiotik menjadi
produk komersil.
 Komponen zat kimia dan spektrum anti bakteri ditentukan dengan menggunakan
bahan mentah selama tahap awal pembentukan.
 Jika komponennya memiliki aktivitas melawan bakteri gram positif  diuji dengan
S.aureus (dengan konsentrasi zat kimia antara 0,1 dan 10 mg/ml pada tabung uji
untuk mendapatkan uji yang memuaskan tugas analis)
 Jika uji belum memuaskan  analis harus meneruskan pekerjaannya.
 Indikasi kisaran sensitivitas suatu sistem uji harus ditemukan sebelum uji
dapat mendekati kisaran sebenarnya.
 E.coli dan S.aureus  rentan terhadap thimerosal dan ph hanya sedikit
mempengaruhi kerentanan
 Salmonella gallinarum secara signifikan lebih rentan daripada bakteri lain dan
uji lebih sensitif pada pH 8 daripada pH 7
 Uji standar hygromycin B  B subtilis dengan metode plating dan aktivitasnya
yang diharapkan melawan bakteri gram positif. Tetapi bagaimanapun hanya
men-trace aktivitas pada S.aureus
 Diperlukan sensitivitas tambahan untuk uji hygromycin B, yang ditunjukkan
oleh kerja dalam medium dengan fosfat rendah pada pH 8
Preparasi Sampel
 Preparasi sampel dapat mempengaruhi uji  pengaruh
konsentrasi zat kimia penghambat dan zat kimia yang
meningkatkan pertumbuhan secara simultan
 Komponen jenis pertama memberikan interferensi/gangguan
positif dengan meningkatkan potensi sampel.
 Komponen jenis kedua menurunkan potensi sampel dengan
merangsang pertumbuhan organisme uji pada tabung.
 Keduanya perlu diselidiki pengaruhnya yang saling meniadakan
 Preparasi sampel harus sesederhana mungkin
Bagaimana gangguan pada sampel dapat diselidiki?
1.Dengan cara membuat kurva standard dosis-respons
yang akurat (uji sampel pada beberapa jenis
konsentrasi dan uji dilakukan berulang kali)
2. Jika uji gagal dan menunjukkan adanya gangguan
dan permasalahan dalam analisis.
3. Jika potensi menunjukkan 2 dari uji kuantitas pada
sistem AUTOTURB berbeda 5 %, interferensi
diperkirakan 10 %  dipastikan ada interferensi.
 Interferensi disebabkan oleh sesuatu dalam sampel, dimana pada standard
tidak terdapat kekurangan
Misal : vitamin dalam ekstrak pakan hewan  (penambahan vitamin
berlebihan dalam medium akan mengurangi bias, tetapi interferensi positif
dapat dideteksi) dalam pakan hewan interferensi positif dan negatif dapat
diamati
 Vitamin, asam amino, purin, pirimidin, mineral dan gula dalam ekstrak
menyebabkan peningkatan kecepatan pertumbuhan organisme.
 Kontaminasi merubah kecepatan pertumbuhan 0,1%  perubahan
pertumbuhan mungkin ditunjukkan sebagai bias dalam uji.
 Sampel dengan proses fermentasi  dapat menimbulkan permasalahan,
karena banyaknya variasi dalam nutrisi dan juga banyaknya agen antibakteri.
 Ekstraksi dan pengenceran untuk pengujian konsentrasi merupakan metode
utama yang dilakukan dalam preparasi sampel.
Organisme Uji dan pH Medium
•
•
•
•
•
•
•
•
Biasanya organisme uji adalah strain bakteri yang terdapat dimana-mana.
Bakteri ini dikultivasi untuk beberapa tahun pada medium sederhana dan tumbuh baik
dalam medium cair.
Bakteri yang sering digunakan dalam uji fotometri dapat dilihat pada tabel I berikut.
Lebih banyak lagi spesies bakteri yang harus diselidiki, terutama untuk keperluan pengujian
sensitifitas/resistensi terhadap zat kimia ke-2
Salah satu cara termudah untuk merubah sensitivitas sistem uji adalah dengan merubah pH
Aturan umum sensitivitas pengujian untuk antibiotik dengan kadar asam (seperti penisilin
and sepalosporin) akan meningkat dengan menurunnya pH, dimana antibiotik dasar (seperti
eritromisin,streptomisin dan tiolisin) akan meningkat dengan meningkatnya pH dan untuk
antibiotik netral (kloromfenikoll) biasanya tidak tergantung pada pH sistem uji.
Batas peningkatan dalam sensitivitas disebabkan oleh perubahan pH dibatasi oleh pH
pertumbuhan organisme dan uji stabilitas antibiotik
Beberapa karakteristik sistem uji dapat dilihat pada tabel II  terdapat daftar antibiotik, uji
bakteri, medium, pH, dan laporan sensitivitas sebagai respon medium
Tabel I
Tabel II
INOKULUM
 Organisme uji (seperti pada tabel I) merupakan strain lama laboraturium dan
dipertahankan pada medium agar G dan R No.1
 Kultur tusuk (Stab) digunakan untuk S.paecalis dan agar miring untuk
organisme yang lain.
 Pemindahan dilakukan dari agar miring ke agar miring .
 Seluruh bakteri disimpan/diawetkan dengan cara menyimpan suspensi dalam
ampul tertutup dalam nitrogen cair pada pendingin.
 Seluruh kultur mungkin termutasi dan terkontaminasi
 Mutan  mungkin lebih resisten dari organisme awalnya.
 Subkultur harus dikerjakan  menjaga agar kultur tetap murni.
 Kultur yang baru harus diuji sebelum mengganti kultur yang lama.
 Inokulum untuk uji  inokulum yang tua, muda, dalam fase lag atau dalam
fase log (semuanya dapat digunakan)
 Bakteri uji tumbuh dengan baik pada Groth G dan R No 3 pada suhu 37 0
 Kultur yang didiamkan semalam (overnight) menghasilkan inokulum dalam fase lag.
 Pada kultur overnight  tambahkan 0,5% glukosa kocok untuk aerasi, inkubasi selama 2 jam dan
inokulum berada pada fase log
 Seluruh inokulum harus distandarisasi dengan mengukur turbiditas, terutama fotometer harus
dikalibrasi.
 Konsentrasi yang sama pada jenis inokulum yang sama harus digunakan untuk uji khusus.
 Sampel uji diinkubasi dengan panjang waktu yang sama dan kurva standar akan hampir sama
dari hari ke hari
 Keseragaman respons ditunjukkan oleh kontrol yang dilakukan untuk menambah kepercayaan
suatu pengujian.
 Jenis inokulum dan konsentrasi bakteri yang akan diinokulasikan dalam medium cair uji antibiotik
harus ditentukan untuk tiap-tiap zat kimia yang diujikan.
 Semakin besar konsentrasi bakteri, semakin kurang sensitif terhadap uji dan semakin pendek
waktu inkubasi yang diperlukan untuk mencapai populasi standar pada konsentrasi 0 dalam
tabung pada pengujian antibiotik. Jenis dan tingkat inokulum harus dipilih untuk mencapai
sensitivitas, keakuratan, garis dosis-respons dan waktu inkubasi yang diperlukan.
 Penting  masing-masing tabung terdiri dari inokulum yang sama karena kesalahan dapat
terjadi dalam konsentrasi awal bakteri uji akan menyebabkan kesalahan yang sama pada akhir
uji.
Medium dan Buffer
 Uji medium harus menentukan kebutuhan minimum untuk organisme uji
 Medium terdiri dari sumber nitrogen, sumber energi, mineral essensial, vitamin
essensial, dan zat kimia lain yang diperlukan untuk pertumbuhan.
 Medium untuk uji antibiotik yang biasa digunakan adalah G dan R N0. 3 
terdiri dari campuran produk seperti pepton, ekstrak daging, yeast hidroslisat,
casein hidrolisat, NaCl dan Potasium Fosfat.
Dengan asumsi medium yang disediakan cukup dalam segala hal dan
kebanyakan sama untuk yang lainnya.
 Tergantung pada organisme uji dan antibiotik yang digunakan medium
mungkin tepat, kekurangan atau terlalu kaya nutrisi.
Contoh S. aureus yang ditumbuhkan pada media cair G dan R No.3 cukup
untuk uji eritromisin dan penisilin, meskipun kekurangan mineral dan vitamin.
Penambahan mineral dan vitamin meningkatkan kecepatan pertumbuhan
S.aureus (menyebabkan interferensi negatif)
 Tersedianya medium yang cukup dan ketersediaan medium untuk beberapa
uji sehingga hasil cukup konsisten.
 Banyak bakteri memerlukan vitamin B (untuk pertumbuhannya).
 Kebutuhan vitamin untuk organisme uji penting  karena standar dan sampel
tidak selalu mengandung konsentrasi vitamin yang sama dan medium tidak
mengandung konsentrasi vitamin esensial yang optimal.
 Tetapi vitamin dalam ekstrak pakan ternak  mengganggu uji antibiotik
dengan mengganggu kecepatan pertumbuhan, sehingga hasilnya akan bias.
 Nutrien lain seperti asam amino dan lemak juga dapat mengganggu uji,
tergantung pada kebutuhan organisme uji dan komposisi medium.
 Medium sintetik jarang digunakan dalam uji antibiotik.
 Medium harus dipersiapkan dengan prosedur dan komposisi yang akurat 
semaikin sedikit langkah kerja, semakin besar kemungkinan pengerjaan tanpa
kesalahan.
 pH medium sangat penting. Pada uji antibiotik, misalnya:
pH 6,7,8  untuk uji penisilin
8
 untuk uji tylosin
7
 untuk uji eritromisin
 pH ditingkatkan dengan menambah NaOH
pH diturunkan dengan menambah HCl
 Saat mengerjakan suatu uji yang baru  pH harus diatur untuk memberikan
sensitivitas yang diperlukan
 Karena pH penting  kapasitas buffer medium harus dibuat cukup besar untuk
mempertahankan (mendekati) pH yang konstan, setidaknya 2/3 periode inkubasi.
 pH seluruh medium diukur pada suhu 250 C meningkatnya suhu hingga 380 C pH
turun.
 Medium uji yang disterilisasi dengan pemanasan pada suhu 1210C selama 20 –30
menit  medium akan berubah (ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi
coklat)
 Pada beberapa medium uji  perubahan medium tidak menjadi masalah.
 Sterilisasi medium harus dilakukan jika periode inkubasi overnight atau lebih panjang,
atau jika komponen yang akan diisi bukan agen antibakteri.
 Buffer merupakan suatu bagian dari sistem uji dan dapat mempengaruhi
sensitivitas dan kisaran uji.
 Setiap buffer harus menunjukkan nilai positif (tidak mengganggu uji)  harus
dikerjakan dengan membandingkan respons atnibiotik yang dilarutkan dalam
air dengan respons adanya buffer.
 Buffer dapat disterilisasi dengan autoklaf.
 Fosfat ditambahkan pada medium  sebagai buffer dan pH tepat
 Komposisi medium (pengaruhnya terhadap organisme) dipengaruhi oleh
bahan medium, perlakukan medium sebelum ditambahkan dan materi lain
yang ditambahkan pada inokulum
 Tidak ada medium optimum untuk uji antibiotik
Melakukan Percobaan
Keputusan yang dibuat untuk mendesain suatu uji 
• Tedapat kisaran uji, organisme, medium dan pH yang digunakan, waktu inkubasi,
volume sampel, penambahan medium pada tabung uji, serta jumlah tabung untuk tiaptiap tahapan standar dan sampel.
• Contoh :
higromisin B dengan kisaran 0,05 – 0,2 /ml diperlukan dalam tabung uji dan dapat
dicapai dengan menggunakan S. gallinarum dengan medium khusus dengan kadar
fosfat yang rendah.
• Penambahan volume sampel pada tabung uji tergantung pada peralatan yang
tersedia
alat ukur otomatis  untuk mengukur sampel volume antara 0,1 – 0,4 ml per tabung,
manual  0,5 ml (dengan pipet needle-tipped), 1 ml dengan transfer pipet.
• Dilakukan pada 2 tabung uji pada tiap tahapan untuk sampel dan standard  cukup
• Masing-masing sampel harus diuji pada 2 tahapan uji untuk menguji identitas standar
dan sampel dan untuk memastikan pada analis bahwa tidak ada interferensi/gangguan
(tidak pernah diasumsikan bahwa sampel sangat murni)
• Konsentrasi terendah  10 % penghambat pertumbuhan
Konsentrasi tertinggi  tidak lebih dari 80% penghambat pertumbuhan
organisme uji
• Jumlah titik pada kurva standar mempengaruhi keakuratan yang
diperlukan, kisaran, jenis grafik, dan unit dimana turbiditas diukur.
• Aturan yang baik  menggunakan rentang yang pendek untuk
standard yang mencakup seluruh sampel.
Misal: jika sampel dapat diencerkan dalam kisaran yang sempit sebagi
preparasi farmasi, kurva standar menjadi pendek (uji preparasi
eritromisin  sampel diencerkan + 0,35 dan 0,45 g/ml dan standar
0,3 ,0,4 dan 0,5 g/ml )
• Sistem uji antibiotik  bentuk terbaik garis dosis-respons harus sama
dari tes ke tes.
Waktu dan Suhu Inkubasi
 Untuk uji biasanya bakteri tumbuh degan baik pada suhu 37,50 C dan
suhu tersebut digunakan untuk uji inkubasi.
 Sedikit sekali diketahui suhu terbaik yang dapat digunakan dalam
sistem uji. Pada sistem uji yang umum  harus diselidiki sensitivitas
dan keakuratan
 Yang terpenting adalah standard dan sampel harus berada pada suhu
yang sama
 Waktu inkubasi beberapa uji dapat sangat bervariasi tanpa
mempengaruhi sampel saat menggunakan sistem AUTOTURB atau
sejenisnya.
 Waktu inkubasi yang lama akan mengurangi kemiringan garis dosis
respons.
 Waktu inkubasi dapat ditemukan hanya dengan melakukan percobaan.
Penghentian Pertumbuhan
Pertumbuhan pada uji bakteri dapat dihentikan dengan pemanasan atau
dengan penambahan zat kimia
Pengukuran Pertumbuhan
Pengukuran turbiditas suspensi bakteri dalam tabungpaling akurat.
Turbiditas harus diukur dengan peralatan yang stabil.
Kalkulasi Potensi
log N terhadap C, log OD terhadap C, dan log C terhadap T berada dalam
bentuk yang cukup untuk menghitung potensi dengan menggunakan komputer
digital.
Pengujian Metode
1.
2.
•
Menguji setiap titik pada kurva standar sebagai
sampel.
Mempersiapkan konsentrasi intermediet standard
dalam konsentrasi dengan jarak yang berdekatan
pada kurva standar
Prosedur uji  bebas dari bias, dapat diterima,
potensi sampel tidak tergantung pada uji konsentrasi,
dan diperoleh secara lengkap penambahan standar
pada sampel.
TERIMA KASIH