6. Fusi Protoplas (perubahan genetis)

10/16/2013
Materi Kuliah
Bioteknologi Pertanian
TEKNIK FUSI SEL:
Isolasi Protoplasma
Fusi protoplasma
Protoplasma
• Sel tanpa dinding sel
• Dapat digunakan sebagai eksplan
• Digunakan untuk rekayasa genetika
– Paling sering untuk ekspresi transien
– transformasi konifer
• Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik
Fusi Protoplas:
Mengapa menggunakan ini?
• Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan
• Mengatasi tanaman yang incompatibilitas
• Dimungkinkan untuk persilangan secara luas
• Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan
kualitas
• Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin
memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini
• Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .
1
10/16/2013
Terminologi dalam teknik fusi sel
• Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg
berbeda jenisnya
• Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel
protoplasma
• Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih
Perbedaan Hibrida somatik dan hibrida seksual :
Hibrida Somatik
Hibrida Seksual
1.Mempunyai organel dr
kedua sel tetua yang
bersatu dalam satu sel
Berisi organel yang
berasal dari tetua betina
2.Hasil fusi terdapat
genom inti dari kedua sel
tetua
Genom ½ berasal dr tetua
betina dan ½ dari tetua
jantan
3. Menghasilkan tan ploidi
2 X lipat
Ploidi sama dengan
tetuanya
Hibridisasi somatik
2
10/16/2013
Produksi Hibrida Melalui Fusi
Protoplas
Empat tahap untuk produksi hibrida:
• Isolasi Protoplas
• FusiProtoplas
• Seleksi Hibrida
• Regenerasi tanaman
1.
2.
3.
4.
5.
Tahapan Fusi Protoplas
Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi
protoplas
Mencari prosedur yang tepat untuk
mendapatkan hasil fusi yang mempunyai
persentase tinggi dalam menghasilkan
heterokarion binukleat
Seleksi heterokarion setelah fusi
Kultur heterokarion dengan persentase
pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi
Analisis karakter hibrid/sibrid dan konstitusi
genetik dari tanaman yang dihasilkan
Persyaratan fusi :
 Carlson et al. (1972), Power et al. (1975) – persyaratan
tumbuh diferensial hibrida untuk menghilangkan
protoplas 2 (dua) dua donor spesies
 Ahli lain – menggunakan senyawa kimia untuk
menyeleksi protoplas hibrida atau menghilangkan
protoplas tetua
Metode seleksi :
Menggunakan penanda genetik yang dapat dideteksi
secara visual (defisiensi klorofil)
3
10/16/2013
Metode Fusi Protoplas :
1. Pemilihan protoplas tetua
2. Induksi fusi secara kimia
3. Fusi secara elektrik
4. Praktek elektrofusi
5. Mikrofusi
Isolasi Protoplas secara enzimatik
• Daun: lapisan epidermis dibuang
• Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum)
– Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan
– Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol 500600 mM/L
• Tambahkan enzim
– Selulase, hemiselulase, pektinase
– Terjadi degradasi dinding sel
• Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi
• Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel
1. Protoplas Tetua
• Asal : jaringan hipokotil/daun dari tunas kultur in vitro atau
kultur suspensi sel umur 3-5 hari
• Protoplas mesopil dan hipokotil mempunyai kapasitas
regenerasi lebih baik
• Enzim untuk isolasi protoplas kombinasi dari pektinase
(untuk pemisahan sel) dan selulase (penghancuran
dinding sel)
• Pemilihan enzim dan lamanya penghancuran dinding sel
mempengaruhi viabilitas protoplas dan fusogenik
Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma
•20 ml suspensi sel, dipisahkan media dg selnya
•Tambahkan 10 ml larutan enzim, campur, masukkan ke petridish
• Inkubasikan 28o C 6 jam, saring dg saringan 50-100 μm
•Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge, cuci dg
menambahkan 5ml washing medium melalui filter
•Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit
•Buang supernatan, ulangi sentrifugasi, tambah 10 ml float
medium, centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit
•Ambil larutan terkeruh, tambah 5 ml media kultur, centrifuge lagi
•Supernatant dibuang, tambah media kultur 5 ml, hitung kerapatan
protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml
•Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab
•Inkubasi di cahaya rendah, tambahkan 100 ul media kultur setelah
7-10 hari
4
10/16/2013
Media kultur protoplasma
• Umumnya menggunakan media MS atau B5
dan modifikasinya
• Diberi larutan osmotikum: manitol atau
sorbitol 500-600 mM/L
• Penambahan 1 mM/L CaCl2 meningkatkan
pembelahan sel
• ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi
• Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA
• Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P
2. Induksi Fusi secara Kimiawi
• Membran protoplas bermuatan negatif dan
protoplas menjadi saling tolak menolak 
berdekatan  mengubah pH medium dg
polikation atau efek dehidrasi
• PEG – menyebabkan aglutinasi
(penggumpalan), tergantung suhu medium,
BM PEG, konsentrasi dan lama perlakuan PEG
• Galur sel mempengaruhi optimasi fusi.
Protoplas dg vakuola kecil lebih mudah fusi
dibandingkan dg bervakuola besar
Hasil isolasi protoplasma
Protoplas
ma dalam
larutan
Daun plantlet kentang sbg
sumber protoplasma
FUSI PROTOPLAS:
• Tidak terjadi secara spontan
• Selain bisa diinduksi dengan menambah
promotor fusi berupa senyawa kimia PEG, juga
bisa diinduksi secara elektrik atau diberi virus
• Tiga kemungkinan produk hasil fusi:
– Sel A=Sel A
– Sel B=Sel B
– Sel A=Sel B
• Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion)
5
10/16/2013
Sel A
Tambahkan Enzim
Sel B
Tambah Promotor Fusi
PROTOPLASMA
DILIHAT DI BAWAH
MIKROSKOP
HASIL FUSI
PROTOPLASMA
6
10/16/2013
Seleksi dan kultur heterokarion
1. Penanda yang dapat dilihat
Misal :
fluorochrome – klorofil berwarna merah (mesofil)
fluorescein diaceate – kloroplas hijau kekuningan
(kloroplas)
2. Sortasi sel menggunakan flowcytometer (pemilih
sel yang diaktifkan dengan fluoresen)
3. Penanda biokimia menggunakan nitrat sebagai
sumber nitrogen  planlet yang tumbuh sebagai
hibrid
4. Kultur heterokarion  sangat tergantung materi
yang difusikan
Regenerasi Protoplasma
menjadi plantlet
•Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media
kultur
• Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah
meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri
• Tekanan osmose media
perlahan-lahan diubah dg cara
meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol
• Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan
osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel
• Terjadi ketidakstabilan genetik dan atau kromosom
• Menghasilkan tanaman bebas patogen
KULTUR
PROTOPLASMA
UNTUK MERAKIT
TANAMAN
HIBRIDA
Regenerasi
protoplasma menjadi
plantlet bersifat
hibrida
Contoh Fusi Protoplas: Hibrida Intergenerik
Wortel X Aegopdium
Kedelai X Alfalfa
Wortel X Barlei
Kedelai X Barlei
Wortel X Petunia
Kedelai X Jagung
Wortel X Tembakau
Kedelai X Meadow Saffron
Jagung X Oat
Kedelai X Pea
Jagung X Sorghum
Kedelai X Tembakau
Petunia X Fava Bean
Kedelai X Rape
Petunia X Parthenocissus
Tomat X Kentang
7
10/16/2013
Contoh Fusi Protoplas : Hibrida interspesifik
Dacus carota
X D. capillifplius
Datura innoxia
X D. discolor
Datura innoxia
X D. stramonium
Nicotiana glauca
X N. langsdorffii
Nicotiana sylvertris X N. knightiana
Nicotiana tabacum X N. debneyi
Nicotiana tabacum X N. sylvestris
Petunia hybrida
LATIHAN
• Jelaskan pengertian hibridisasi somatik, fusi protoplas, variasi
somaklonal, kultur heterokarion!
• Jelaskan tahapan fusi protoplas dan contoh aplikasinya!
• Sebutkan beberapa cara dalam seleksi heterokarion!
• Sebutkan beberapa variasi somaklonal yang terjadi pada
hibridisasi somatik!
• Mengapa dalam kultur anther diperlukan konfirmasi jumlah
kromosom?
• Jelaskan perbedaan hasil hibridisasi secara seksual, hibridisasi
somatik, dan tanaman sibrid! Lengkapi dengan gambar!
X P. parodii
8