Laporan Praktikum 3

Laporan Praktikum 3
Isolasi Protoplas
Nama
: Cokhy Indira Fasha
NIM
: 10699044
Kelompok
:4
Tanggal Praktikum : 22 Oktober 2001
Tanggal Laporan
: 29 Oktober 2001
Asisten
: Luluk
Departemen Biologi
Institut Teknologi Bandung
2001
Laporan Praktikum 3
Isolasi Protoplas
I. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah :
1. Melakukan isolasi protoplas dari jaringan mesofil daun dengan menggunakan enzim.
2. Menguji viabilitas dan kemampuan regenerasi protoplas.
II. Cara Kerja dan Pengamatan
III. Pembahasan
Percobaan ini bertujuan untuk memisahkan protoplas dari dinding sel mesofil.
Protoplast ialah bagian sel yang aktif bermetabolisme dan jelas terpisah dari dinding sel.
Bagian ini merupakan isi sel termasuk membran sel, tetapi biasanya tidak mencakup massa
sekresi atau bahan yang ditelan (Abercombie :1993).
Protoplast ini dibagi menjadi tiga bagian utama, yaitu sitoplasma, nukleus, dan vakuola.
Sitoplasma merupakan matriks berair yang kompleks yang mengandung banyak molekul,
sebagian dalam suspensi koloid. Di dalam sitoplasma terdapat organel-organel sel yang
masing-masing memiliki fungsi yang spesifik serta plasmalema yang mengatur zat untuk
ditransportasikan masuk-keluar sel. Nukleus merupakan pusat organisasi sel, di sinilah
terjadi transkripsi mRNA yang nantinya akan mentranslasikan protein yang mengatur
metabolisme sel. Vakuola adalah volume air dan bahan terlarut yang terbungkus membran,
biasanya mencakup 80-90% atau lebih bagian sel tumbuhan dewasa. (Salisbury : 1995)
Di sebelah luar protoplast terdapat dinding sel. Dinding sel terdiri dari dinding sel
primer, lamela tengah dan dinding sel sekunder. Dinding sel primer memiliki ketebalan yang
kecil, tebalnya antara 1-3 m. Dinding sel primer ini terdiri dari 9-25% selulosa. Molekul
selulosa yang panjang dan tidak bercabang membentuk serat silindris panjang yang disebut
mikrofibril. Karena susunan selulosanya searah, maka mikrofibril bersifat seperti kristal dan
memiliki daya regang yang besar. Selain selulosa, pada dinding sel primer terdapat pula
hemiselulosa yang bercabang-cabang dan senyawa pektat yang terhidrasi. Dinding sel
sekunder terdapat pada beberapa jenis sel yang telah berhenti membesar, contohnya pada
xilem dewasa. Pada hampir semua sel kayu, setelah dinding sel sekundernya disekresikan,
protoplast mati dan isinya hilang dari sel tersebut sehingga hanya dindingnya yang tertinggal.
Dinding sel sekunder umumya lebih tebal dari dinding sel primer. Dinding sel sekunder terdiri
dari +/- 41-45% selulosa, 30% hemiselulosa, dan kadang-kadang 22-28% lignin yang
menyebabkan dinding sel sekunder ini tidak mudah dimampatkan dan diubah bentuknya.
Senyawa pektat yang berupa gel merekatkan sel-sel yang berdampingan, membentuk
lamela tengah. (Salisbury : 1995)
Pada percobaan tahapan kerja yang dilakukan ialah isolasi protoplas dan pengamatan
viabilitas protoplas, sedangkan penkulturan dan regenerasi protoplas serta pembentukan
dinding sel baru tidak dilakukan karena keterbatasan waktu.
Isolasi protoplas dilakukan dengan metode Ochatt dan Power yang dimodifikasi. Pada
metode ini, potongan daun yang telah dihilangkan lapisan epidermisnya dengan cara dikerik
direndam dalam larutan enzim dan diinkubasi dengan cara dikocok pada shaker (50 rpm)
dalam keadaan gelap selama 2 jam. Pada percobaan ini digunakan mesofil dengan alasan
antara lain :
 Aktif menghasilkan gula yang merupakan monomer dari selulosa sehingga lebih
mudah untuk membentuk dinding sel kembali.
 Mudah diisolasi dari tumbuhan
Penghilangan lapisan epidermis dengan cara pengerikan ini memiliki latar belakang
bahwa :
 pada sel epidermis terdapat jaringan kompleks yang mrnghalangi pengisolasian
protoplast mesofil.
 beberapa sel-sel epidermis memiliki deferensiasi yang menghasilkan metabolit
sekunder yang dapat menyulitkan percobaan, seperti contohnya pada rambut
kelenjar.
Setelah didapatkan sel mesofil, daun direndam dalam larutan enzim yang mengandung
Cellulase RS, Hemicellulase, Macerozyme R-10 dan sorbitol sambil di-shaker 50 rpm pada
kondisi gelap. Enzim Cellulase RS merupakan salah satu enzim selulase yang akan
menghidrolisis selulase yang merupakan polimer dari glukosa yang terpolimerisasi pada
ikatan (1-4). Enzim Hemicellulase memiliki aktivitas menghidrolisis hemiselulosa sedangkan
Maceroenzim R-10 berfungsi dalam maserasi sel, yaitu penguraian lamela tengah sehingga
dipisahkan sel yang bertumpuk-tumpuk menjadi satuan-satuan sel. Sedangkan sorbitol
berfungsi sebagai buffer pH yang akan menentukan efisiensi kerja enzim. Tujuan penshaker-an adalah agar terdapat energi mekanis yang ikut membantu proses enzimatis terjadi
dan lama penginkubasian, yaitu selama 2 jam bertujuan agar produk yang dihasilkan
optimum. Tujuan penginkubasian di tempat gelap adalah :
 agar tidak terjadi fotosintesis yang akan mengganggu reaksi
 agar enzim dapat bekerja optimum.
Setelah dua jam inkubasi, larutan disaring untuk memisahkan potongan daun dan
dinding sel yang telah terdegradasi yang terdapat pada saringan dari protoplas yang
terdapat pada filtrat. Filtrat yang didapat dari hasil penyaringan diberi pewarnaan dengan
evans blue. Tujuan pewarnaan ini adalah untuk membedakan mana yang merupakan
protoplast yang viabel, mana yang tidak. Hal ini dapat ditandai dengan terwarna birunya sel
yang tidak viabel, sedangkan yang masih viabel tidak. Penyebab terjadinya hal ini ialah
bahwa pada sel yang tidak viabel karena rusaknya sistem membran sehingga yang
seharusnya membran ini permeabel selektif terhadap lingkungan, membran ini menjadi rusak
dan melalukan zat warna sehingga sel ikut terwarna menjadi biru.
IV. Kesimpulan
1. Enzim selulase dan hemiselulase berfungsi dalam proses penguraian dinding sel,
sedangkan macerozyme berfungsi dalam proses maserasi sel.
2. Protoplas yang masih viabel dapat ditandai dengan membran sel yang masih bersifat
permeabel selektif pada percobaan ini ditandai dengan tidak terserapnya warna biru oleh
protoplas.
3. Sebaliknya, protoplas yang sudah tidak viabel ditandai dengan membrab sel yang sudah
hilang sifat permeabel selektifnya, pada percobaan ini ditandai dengan terwarna birunya
protoplas.
V. Daftar Pustaka
1. Abercombe, M. et al. 1993. Dictionary of Biology : 8th ed. Penguin. England.
2. Albert, B. et al. 1994. Biologi Molekuler Sel, 2nd ed. Gramedia. Jakarta.
3. Campbell, Neil A. 1996. Biology 4th ed. Addison Wesley Longman. Singapore.
4. Karp, Gerald. 1996. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiment. John Willey
and Sons, Inc. New York.
5. Salisbury, F. and Ross, C.W. Fisiologi Tumbuhan jilid 1. Penerbit ITB. Bandung.