Bacillus sp. Asal Rizosfer Kedelai yang Berpotensi

TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus sp.
Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang yang
mempunyai kemampuan membentuk endospora pada kondisi yang kurang
menguntungkan. Bakteri ini dapat ditemukan dan dapat diisolasi dari tanah.
Bentuk endospora merupakan nilai lebih bagi bakteri yang sangat terkait secara
ekologi di dalam tanah. Kemampuannya membentuk endospora menyebabkan
bakteri ini relatif lebih tahan terhadap kondisi lingkungan yang kurang
menguntungkan dan kritis misalnya radiasi, panas, asam, desinfektan, kekeringan,
nutrisi yang terbatas dan dapat dorman dalam jangka waktu yang lama hingga
bertahun-tahun. Struktur spora tidak akan terjadi jika sel sedang berada pada fase
pembelahan secara eksponensial tetapi akan dibentuk terutama pada kondisi
nutrisi esensial misalnya karbon dan nitrogen terbatas. Pada Bacillus subtilis
sporulasi terjadi sekitar 8 jam dengan melibatkan hingga 200 gen (Madigan et al.
2000). Selain itu Bacillus sp. mempunyai sifat katalase positif sehingga mampu
menguraikan peroksida toksik menjadi air dan oksigen. Bacillus sp. termasuk
kelompok PGPR yang memiliki banyak potensi karena mampu memproduksi
IAA, melarutkan fosfat, memsekresi siderofor dan berperan sebagai agens
biokontrol dengan menginduksi sistem kekebalan tanaman serta menghasilkan
antibiotik (Compant et al. 2005).
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR
Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) pertama kali didefinisikan
oleh Kloepper dan Schroth (1978) untuk mendeskripsikan bakteri tanah yang
berkumpul di akar setelah benih ditanam. PGPR dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman dengan berbagai mekanisme antara lain fiksasi nitrogen,
produksi siderofor, sebagai pengkelat besi dan sintesis fitohormon. Bakteri
tersebut dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman dengan meningkatkan sistem
perakaran tanaman. Menurut Enebak et al. 1998 (diacu dalam Mello et al. 2004)
PGPR dapat mempengaruhi pertumbuhan tanaman melalui satu mekanisme atau
lebih termasuk meningkatkan fiksasi nitrogen, produksi auksin, giberelin,
5
sitokinin, etilen, melarutkan fosfat dan oksidasi sulfur, meningkatkan ketersediaan
nitrat, produksi antibiotik ekstraseluler, enzim litik, asam hidrosianik,
meningkatkan permiabilitas akar dan kompetisi dalam nutrisi. Kemampuan
rizobakteria dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman sangat bergantung pada
karakter yang merupakan ciri khas dan spesifik gen yang dimilikinya (Nelson
2004).
Mikroorganisme mampu menghasilkan hormon tumbuhan seperti auksin,
sitokinin dan giberelin (Leveau & Lindow 2005). Asam indol asetat atau Indol
acetic acid (IAA) merupakan hormon auksin pertama pada tumbuhan yang
mengendalikan berbagai proses fisiologi penting meliputi pembelahan dan
perkembangan sel, diferensiasi jaringan serta respons terhadap cahaya dan
gravitasi (Salisbury & Ross 1992). Tumbuhan mungkin saja tidak mampu
mencukupi kebutuhan auksin untuk pertumbuhannya secara optimal sehingga
diperlukan tambahan hormon pemacu pertumbuhan dari luar. Menurut Patten dan
Glick (2002) respons tanaman terhadap IAA yang dihasilkan mikrob berbedabeda bergantung pada spesies tanaman dan konsentrasi IAA yang dihasilkan.
Menurut Leveau dan Lindow (2005) hormon IAA atau yang dikenal
sebagai auksin merupakan hormon pemacu pertumbuhan dan mengontrol berbagai
proses fisiologi seperti pembelahan sel, diferensiasi jaringan dan respons terhadap
cahaya dan gravitasi. Bakteri penghasil IAA mempunyai kemampuan membantu
berbagai proses tersebut dengan memasukkan IAA ke dalam pool auksin tanaman.
Akar merupakan organ tanaman yang paling sensitif terhadap fluktuasi kadar IAA
dan responsnya pada peningkatan jumlah IAA eksogenous meluas dari
pemanjangan akar primer, pembentukan akar lateral dan akar liar, sampai
penghentian pertumbuhan.
Biosintesis IAA oleh mikrob ditingkatkan oleh prekursor fisiologi tertentu
yaitu L-Tryptophan (Husen 2003). Protein –TRAP (AT) yang diproduksi oleh
trpA pada Bacillus subtilis dapat mengikat dan menghambat aktifitas triptofan
protein yang berikatan lemah antara Trp-RNA (TRAP). Pada Bacillus subtilis
diperlukan ekspresi dari tujuh gen untuk berlangsungnya biosintesis L-triptofan
dari asam korismat termasuk prekursor asam amino amoniak. Enam dari tujuh gen
terorganisasi sebagai operan triptofan, suboperan dalam superoperon aromatik.
6
Gen triptofan yang ketujuh trpG (pabA) terletak pada operan folat dan
menghasilkan polipeptida yang berperan dalam biosintesis triptofan dan folat
(Wen & Charles 2005).
Manulis et al. (1998) mengemukakan bahwa beberapa lintasan sintesis
IAA pada bakteri yang melibatkan senyawa intermediat indole-3-pyruvate (IpyA)
yaitu indole-3-acetamide (IAM), tryptamine (TAM) dan indole-3-acetonitrile
(IAN). Jalur utama yang ada pada bakteri yaitu lintasan IAM dan IPyA. Bakteri
yang memproduksi IAA menstimulasi pertumbuhan sistem perakaran inang.
Sel tumbuhan memproduksi IAA dari L-tripthofan melalui intermediet
IAM, lintasannya melalui enzim triptofan 2-monooksenase yang mengkatalisis
konversi triptofan menjadi IAM dan enzim indoleacetamid hidrolase yang
mengkatalisis konversi IAM menjadi IAA (Mazzola & White 1993). Tien et al.
(1979) mengamati bahwa produksi IAA meningkat sesuai dengan peningkatan
konsentrasi triptofan dari 1 – 100 ug / ml. Konsentrasi IAA juga meningkat
seiring dengan umur kultur sampai bakteri mencapai fase stasioner. Pengocokan
lebih disukai untuk memproduksi IAA, terutama pada yang mengandung nitrogen
sedangkan fitohormon lainnya juga terdeteksi pada media kultur yaitu giberelin
dan senyawa serupa sitokinin.
Produksi IAA tidak berfungsi nyata sebagai hormon dalam sel bakteri,
dimungkinkan terdapat dalam sel bakteri karena hormon tersebut berperan penting
dalam interaksi antara bakteri dan tanaman. Pada penelitian yang dilakukan Patten
dan Glick (2002) diperoleh bahwa bakteri yang memproduksi IAA menstimulasi
pertumbuhan sistem perakaran inang. Keuntungan dari asosiasi tanaman dengan
bakteri adalah mensuplai sebanyak produk metabolit fiksasi karbon oleh
tumbuhan yang telah hilang ke rhizosfer sebagai eksudat (Martens et al. 1994,
diacu dalam Patten & Glick 2002).
Reaksi awal pengubahan triptofan menjadi indol-3-piruvat dikatalisis oleh
aminotransferase aromatik, dimana empat enzim berhasil diidentifikasi pada
Azospirillum lipoferum. Enzim-enzim yang ditemukan ini spesifik terhadap
berbagai asam amino aromatik dan tidak hanya pada triptofan, sehingga deteksi
pada protein-protein ini kurang membuktikan bahwa IAA disintesis melalui
indole-3-piruvat pada Azospirillum.
7
iaaM
Indole-acetamide
Triptofan
typtamine
Indole-3-pyruvic acid
Indole-3-acetaldehyde
iaaH
ipdC
Indole-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-acetic acid
Inndole-3-acetic acid
Gambar 1 Diagram alir lintasan biosintesis IAA pada Bakteri (Hartman et al.
1983; Brandl et al. 1996; Manulis et al. 1980). Gen-gen iaaM, iaaH
dan ipdC masing-masing menyandikan tryptohan-2-monooygenase,
indole-3-acetamide hydrolase dan indole-pyruvat decarboxylase.
Fosfat merupakan salah satu unsur hara yang sangat diperlukan oleh
tanaman. Di dalam tanah hanya sebagian kecil saja fosfat yang dapat diserap oleh
tanaman karena masih terikat dengan kation logam misalnya Fe, Ca dan Al.
Adanya kemampuan bakteri dalam melarutkan fosfat berpotensi untuk
meningkatkan penyerapan unsur fosfat ke dalam tanaman apabila tersedia cukup
endapan fosfat dalam tanah. Bakteri pelarut fosfat dapat menyediakan fosfat
terikat menjadi fosfat yang dapat terlarut sehingga dapat diserap oleh tanaman.
Mekanisme utama pelarutan fosfat pada bakteri dengan memisahkan kation dari
senyawa asam menggunakan asam organik yang disintesisnya (Altomare et al.
1999). Bakteri pelarut fosfat melepaskan ikatan ion fosfat anorganik yang sukar
larut dengan mensekresikan sejumlah asam organik. Beberapa bakteri yang
dilaporkan mempunyai aktifitas fitase (enzim kelompok fosfomonoesterase) yang
mampu menghidrolisis polifosfat organik tak larut (fitat) menjadi rangkaian ester
fosfat dengan bobot molekul yang rendah dari myo-inositol dan fosfat yang
penting untuk prokariot dan eukariot. Bakteri yang mempunyai kemampuan
melarutkan fosfat antara lain Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Klebsiella
terrigena, Pseudomonas spp. dan Enterobacter sp. (Idriss et al. 2002).
8
Siderofor merupakan molekul atau ligan pengkelat besi (Fe3+ ) yang
diproduksi oleh bakteri terutama pada tanah netral dan alkalin yang banyak diteliti
saat ini. Siderofor disekresikan oleh mikroorganisme dan tanaman dari famili
Gramineae sebagai respons terhadap defisiensi unsur besi (Crowley 2001, diacu
dalam Nawangsih 2006). Jenis agen pengkelat besi, siderofor, yang dihasilkan
oleh mikroorganisme antara lain berupa hydroxamate dan enterobactin (pada E.
coli). Hidroxamate mengikat besi ferric (Fe3+) yang direduksi dan dilepaskan ke
dalam sel bakteri sebagai besi ferro (Fe2+) (Madigan 2003). Menurut Nawangsih
(2006) hasil deteksi pada beberapa galur Pseudomonas fluorescens, Bacillus
subtilis, dan B. cereus positif menghasilkan senyawa siderofor. Adanya siderofor
pada bakteri ini mendukung kemampuan bakteri sebagai PGPR karena dapat
bertindak dalam kompetisi dengan mikroorganisme patogen dalam menggunakan
Fe3+ yang konsentrasinya sangat terbatas dalam tanah. Namun pengambilan Fe3+
oleh mikroorganisme ini tidak mempengaruhi kebutuhan tanaman akan besi yang
sangat sedikit dibandingkan dengan mikroorganisme
Kemampuan Bacillus sp. sebagai pengendali penyakit tanaman antara lain
karena kemampuannya memproduksi antibiotik yang diekskresikan saat kultur
memasuki fase stasioner (Madigan et al. 2000) dan produksi metabolit sekunder
misalnya enzim kitinase, mycobacilin, basitrasin dan zwittermicin. Menurut
Benhamou et al. (1996) bakteri endofit Bacillus pumilus strain SE34 dapat
digunakan untuk menginduksi ketahanan secara sistemik pada buncis (Pisum
sativum). Bakteri ini dapat merangsang penebalan dinding sel terutama pada
jaringan korteks dengan produksi kitin sehingga patogen tidak dapat melakukan
penetrasi. Patogen hanya terdistribusi pada jaringan epidermis dan tidak dapat
menyebar ke jaringan korteks. Bacillus subtilis diketahui menunjukkan aktifitas
antagonis terhadap bakteri dan fungi fitopatogen. Sedangkan Bacillus cereus
diketahui dapat mereduksi pertumbuhan miselia Sclerotium rolfsii., Fusarium
oxysporum,
Pythium
aphanidermatum,
Helminthosporium
maydis
dan
Rhizoctonia solani dengan zona inhibisi 35.3% - 53.3 % (Muhammad & Amusa
2003).
9
Kemampuan Bacillus sebagai biokontrol juga dapat terjadi melalui mekanisme
resistensi terinduksi oleh B. subtilis pada tanaman yang diserang cendawan A.
niger (Sailaja et al. 1997).
Fungi Patogen Akar Kedelai
Penyakit-penyakit pada tumbuhan baik pada bagian akar, batang, daun dan
bunga ataupun biji sebagian besar disebabkan oleh fungi. Fungi masuk ke dalam
jaringan tanaman melalui struktur terbuka yang alami pada jaringan tanaman
misalnya stomata lentisel, dan hidatoda atau melalui jaringan tanaman yang
terluka. Beberapa fungi mengkolonisasi tanaman kedelai dan benih secara
asimtom. Beberapa fungi yang dikenal menyerang akar tanaman kedelai antara
lain Rhizoctonia solani penyebab penyakit busuk akar dan rebah kecambah
(damping off) serta Sclerotium rolfsii penyebab penyakit busuk akar dan batang
(Hartman et al. 2001) dan damping off pada benih (Agrios 2004). Kedua fungi ini
menyebabkan penyakit yang cukup serius baik pada akar, batang dan bagianbagian tanaman lainnya.
Rhizoctonia solani merupakan fungi saprofit yang dapat bertahan walau
tidak berada pada tanaman inang. R. solani memiliki sel multinukleat yang
hifanya berwarna coklat dan mampu membentuk sklerotia berwarna coklat hingga
hitam. Fungi ini menginfeksi pada saat penanaman benih dan menginfasi
hipokotil selanjutnya menyebabkan damping off atau jika tidak akan
menyebabkan busuk akar. Semua Rhizoctonia terdapat sebagai miselium steril dan
kadang-kadang sebagai sklerotia kecil tanpa diferensiasi jaringan internal (Agrios
2004). Penggunaan Bacillus megaterium diketahui dapat menurunkan tingkat
penyakit yang disebabkan fungi ini (Hartman et al. 2001).
Tanaman kedelai sangat rentan terhadap serangan S. rolfsii yang
menyerang tanaman sejak pembenihan. S. rolfsii memiliki hifa hialin berseptat,
tidak memproduksi spora aseksual, dan mampu membentuk struktur pertahanan
berupa sklerotia sperikel. Massa miselium yang menyerang jaringan memproduksi
sekret berupa asam oksalat, pektinolitik, selulolitik dan enzim-enzim yang dapat
membunuh dan mengurai jaringan tanaman sebelum penetrasi (Agrios 2004).
10
Gen 16S rRNA
RNA di dalam sel dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok yaitu
kelompok RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen yaitu mRNA, tRNA dan
kelompok rRNA yang tidak berhubungan dengan ekspresi gen. Ribosomal RNA
merupakan salah satu makromolekul yang menarik karena molekul ini bersifat
stabil, terdapat sekitar 83% dari keseluruhan RNA dalam sel dan merupakan
kerangka ribosom yang sangat berperan dalam mekanisme translasi. Semua rRNA
identik secara fungsional yakni terlibat dalam produksi protein, walaupun
demikian sekuen-sekuen di bagian tertentu terus berevolusi dan mengalami
perubahan pada level struktur primer sambil mempertahankan struktur sekunder
dan tersier yang homolog (Gutell et al. 1994).
Kemampuannya mewakili semua informasi filogenetik dan kepraktisannya
menyebabkan sekuen 16S rRNA lebih sesuai digunakan untuk identifikasi bakteri
daripada menggunakan 5S rRNA atau 23S rRNA. Menurut Bottger (1996)
aplikasi molekuler untuk menganalisis keragaman mikrob melalui analisis gen
16S rRNA sesuai untuk mengidentifikasi mikroorganisme karena gen ini terdapat
pada semua organisme prokariot. Molekul 16S rRNA memiliki daerah-daerah
berbeda berupa sekuen yang konservatif dan sekuen lain yang sangat variatif.
Terdapat lebih dari 4000 entri (sekuen yang terdaftar ) yang ada pada database
16S rRNA yang mencakup sekitar 1800 species yang terus bertambah jumlahnya.
Strategi yang sering digunakan untuk melihat keragaman mikrob meliputi tahaptahap isolasi DNA dari komunitas alami, amplifikasi gen 16S rRNA
menggunakan PCR, penapisan klon-klon untuk variabilitas genetik, pemilihan
klon unik untuk disekuen dan menentukan hubungan filogeniknya (Marchesi et al.
1998). Gen 16S rRNA bersifat relatif stabil dalam sel bakteri daripada rRNA yang
biasanya didegradasi dan hanya terdapat pada fase-fase tertentu saja.