ISSN No. 1978-3787 Media Bina Ilmiah29 PERBEDAAN EFEKTIFITAS PEMBERIAN FILTRAT DAUN BAYAM HIJAU DAN BAYAM MERAH (Amaranthus tricolor L) TERHADAP KADAR KOLESTEROL DARAH TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus ) STRAIN Wistar Oleh I Wayan Getas Ersandhi Resnhaleksmana Lalu Rhifqi Arhan Ningrat Dosen pada Poltekkes Kemenkes Mataram Jurusan Analis Kesehatan Abstrak: Peningkatan kadar kolesterol dalam darah akan menyebabkan penyempitan pada pembuluh darah. Penyempitan pembuluh ke arah jantung dapat menimbulkan penyakit jantung koroner sedangkan penyempitan pada pembuluh darah menuju ke otak dapat mengurangi suplai oksigen yang mengakibatkan stroke. Kelebihan kolesterol dalam darah bisa diatasi dengan mengkonsumsi sayur bayam, baik bayam hijau maupun bayam merah (Amaranthus tricolor L).Tujuan Penelitian untuk melihat perbedaan efektifitas pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar.Metodepenelitian ini bersifat true eksperiment dengan analisa data menggunakan uji Independet Sample Test dengan tingkat kepercayaan 95% (α 0,05).Hasil dari uji statistik Paired sample test untuk melihat pengaruh bayam hijau dan bayam merah terhadap kadar kolesterol didapatkan hasil uji berturut-turut p = 0,017 < α = 0,05 (bayam hijau) dan p = 0,006 < α = 0,05 (bayam merah). Hasil uji statistik selanjutnya menggunakan Independent Sample Test menunjukkan bahwa p =0,368> α = 0,05Kesimpulan : tidak ada perbedaan efektifitas pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar. Kata kunci :Kolesterol, bayam hijau, bayam merah, tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar PENDAHULUAN Kemajuan perekonomian sebagai dampak dari pembangunan di negara-negara berkembang sebagaimana di Indonesia menyebabkan perbaikan tingkat hidup. Hal ini menjadikan kesehatan masyarakat meningkat, di samping itu terjadi pula perubahan pola hidup. Perubahan pola hidup ini yang menyebabkan pola penyakit berubah, dari penyakit infeksi dan rawan gizi ke penyakitpenyakit degeneratif, diantaranya adalah penyakit jantung dan pembuluh darah (kardiovaskuler) (Supriyono, 2008). Penyakit Jantung Koroner (PJK), yang termasuk bagian dari penyakit kardiovaskular, merupakan penyakit yang menjadi wabah di dunia modern saat ini. Laporan Badan Kesehatan Dunia (WHO), September 2009, menyebutkan bahwa penyakit tersebut merupakan penyebab kematian utama sampai saat ini. Pada 2004, diperkirakan 17,1 juta orang meninggal karena PJK. Angka ini merupakan 29% dari penyebab kematian global (Yahya, 2010). Salah satu penyebab utama dari penyakit tersebut adalah kolesterol dalam darah. Kolesterol amat berguna bagi tubuh untuk memproduksi berbagai hormon dan penyediaan energi. Persoalan baru timbul bila kadar di dalam darah menjadi abnormal. Bila berlangsung dalam jangka panjang, hal tersebut dapat memicu Penyakit Jantung Koroner (PJK), bahkan serangan jantung dan stroke. Kadar kolesterol darah dipengaruhi juga oleh tingkat kejenuhan lemak makanan. Semakin banyak kadar lemak jenuh dalam makanan yang dikonsumsi, semakin besar kemungkinan meningkatnya kadar kolesterol darah. Tingginya kadar kolesterol dalam darah menyebabkan sebagian kolesterol mengendap pada dinding _____________________________________ http://www.lpsdimataram.com Volume 8, No. 5, Agugstus 2014 30 Media Bina Ilmiah pembuluh darah, yang lambat laun menimbulkan penyempitan pembuluh darah atau disebut dengan atherosklerosis. Kolesterol dibawa oleh lipoprotein yang juga diproduksi dalam hati yang merupakan sarana transportasi bagi kolesterol yang memungkinkan kolesterol ikut dalam peredaran darah (Soenardi, 1995 dan Soeharto, 2004). Untuk mengatasi kolesterol tinggi banyak di antara penderita mengkonsumsi berbagai obatobatan. Namun tanpa diimbangi pola makan yang sehat, usaha tersebut akan sia-sia. Penggunaan obat-obatan secara terus-menerus juga tidak baik untuk tubuh. Berbagai efek samping dari obatobatan tersebut justru bisa menimbulkan penyakit lain.Salah satu cara yang paling baik dalam menurunkan kadar kolesterol adalah dengan mengkonsumsi sayur-sayuran. Sayur-sayuran yang mengandung lutein bisa membantu menurunkan kolesterol dalam darah, salah satunya adalah bayam. Bayam mengandung karotenoid yang dikenal sebagai lutein yang membantu untuk mencegah penumpukan kolesterol dalam sistem peredaran darah (Murtopo, 2013). Bayam merupakan sayuran yang biasa dikonsumsi oleh masyarakat karena selain harganya yang murah, bayam juga mudah didapatkan, dan juga memiliki kandungan lutein baik pada bayam hijau maupun bayam merah. Berdasarkan uraian tersebut, hal inilah yang mendorong penulis untuk melakukan penelitian tentang perbedaan efektifitas pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar. METODE PENELITIAN Penelitian ini merupakan penelitian trueeksperimentdi Laboratorium yaitu pengelompok-kan anggota kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dilakukan berdasarkan acak atau random. Kemudian dilakukan pretest pada kedua kelompok perlakuan. Setelah beberapa waktu dilakukan posttest pada kedua kelompok tersebut (Zainuddin, 2000; Notoatmojo Soekidjo, 2005). _____________________________________________ Volume 8, No. 5, Agustus 2014 ISSN No. 1978-3787 Jumlah unit eksperimen dalam penelitian ini, dibutuhkan 15 ekor hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) Strain Wistar. Penentuan jumlah unit eksperimen didasarkan atas pendapat Weill dalam buku Harmita & Maksum (2008), bahwa jumlah minimal hewan coba yang diperbolehkan adalah 4 ekor. Oleh karenajumlah sampel ada tiga kelompok, yaitu satu kelompok kontrol dan dua kelompok perlakuandengan faktor koreksi 25%, maka jumlah tikus putih yang dibutuhkan 12 ekor ditambah dengan faktor koreksi 25 % = 3 ekor. Jadi, jumlah unit ekperimen secara keseluruhan 15 ekor. Pertimbangan pengambilan unit eksperimen adalah tikus putih jantan, dalam keadaan sehat, berumur 3 – 4 bulan dan telah diaklimatisasi selama 7 hari terhadap air, makanan, hawa dan kondisi laboratorium (Harmita & Maksum, 2008). Bayam yang digunakan yaitu bayam cabutan atau bayam sekul (Amaranthus tricolor L)yang ada di pasaran dengan kriteria : berwarna hijau tua dan merah yang masih segar. Untuk mendapatkan kandungan filtrat daun bayam digunakan 100 gramdaun bayamdengan penambahan aquadest 100 ml yang kemudian di blender dan di saring. Cara pengambilan sampel adalah Non random purposive sampling yaitu pengambilan sampel yang didasarkan pada suatu pertimbangan tertentu yang dibuat oleh peneliti sendiri dan berdasarkan ciri atau sifat-sifat populasi yang sudah diketahui (Notoatmojo, 2005). Yaitu hewan coba tikus putih yang digunakan adalah dengan kriteria : Tikus putih (Rattusnorvegicus) Strain Wistar, berjenis kelamin jantan & sehat, berumur 3 – 4 bulan, berat 200 – 300gram dan telah diaklimatisasi selama 7 hari terhadap air, makanan, dan kondisi laboratorium. Data dari hasil pemeriksaan kadar kolesterol pada hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar setelah pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) pada masing-masing unit eksperimen dianalisis statistik menggunakan Independent Sample Test denCgan tingkat kepercayaan 95% (α = 0,05). Uji statistik dilakukan dengan bantuan komputer program SPSS. http://www.lpsdimataram.com ISSN No. 1978-3787 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Setelah di lakukan penelitian didapatkan hasil yang dapat dilihat pada tabel berikut: Tabel1. Hasil Pemeriksaan kadar kolesterol sebelum dan setelah pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) pada darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar. Data Tabel 1 menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan 1 rata-rata hasil pemeriksaan kadar kolesterol sebelum pemberian filtrat daun bayam hijau selama 9 hari adalah 198,8 mg/dl dan rata-rata hasil pemeriksaan kadar kolesterol setelah pemberian filtrat daun bayam hijau selama 9 hari adalah 174,8 mg/dl. Pada kelompok perlakuan 2 rata-rata hasil pemeriksaan kadar kolesterol sebelum pemberian filtrat daun bayam merah selama 9 hari adalah 185 mg/dl dan rata-rata hasil pemeriksaan kadar kolesterol setelah pemberian filtrat daun bayam merah selama 9 hari adalah 168,8 mg/dl. Sedangkan pada kelompok kontrol, rata-rata kondisi hyperlipidemia adalah sebesar 176,6 mg/dl dan rata-rata hasil pemeriksaan kadar kolesterol pada hewan coba yang telah hyperlipidemia kemudian selama 9 hari hanya dengan memberi pakan standar dan aquadest sebesar 173,4 mg/dl Untuk mengetahui perbedaan efektifitas pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistardilakukan analisa data menggunakan uji statistik dengan menggunakan program SPSS dan didapatkan hasil analisis sebagai berikut : Media Bina Ilmiah31 1. Uji Normalitas Uji normalitas dalam penelitian ini menggunakan Shapiro-wilk yang bertujuan untuk mengetahui apakah data hasil penelitian berdistribusi normal atau tidak. Hasil dari keenam kelompok menunjukkan p > α = 0,05 maka data tersebut berdistribusi normal. 2. Uji Paired Sample Test Uji Paired Sample Test bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar pada kelompok kontrol,perlakuan 1 dan perlakuan 2. Hasil uji Paired sample test pada data perlakuan 1 menunjukkan nilai p = 0,017< α = 0,05 artinya H0 ditolak dan Ha diterima, artinya ada pengaruh pemberian filtrat daun bayam hijau (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar. Hasil uji Paired sample test pada data perlakuan 2 menunjukkan nilai p = 0,006< α = 0,05 artinya H0 ditolak dan Ha diterima, artinya ada pengaruh pemberian filtrat daun bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar. 3. Uji Independent Sample Test Uji IndependentSample Test bertujuan untuk mengetahuiperbedaan efektifitas pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistarpada kelompok perlakuan 1 dan perlakuan 2. Hasil uji Independent Sample Test pada data menunjukkan nilai p = 0,368> α = 0,05 artinya H0 diterima, artinya tidak ada perbedaan efektifitas pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar. Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi penurunan kadar kolesterol baik pada kelompok hewan coba yang di beri filtrat daun bayam hijau maupun kelompok hewan coba yang diberi filtrat daun bayam merah. Pada kelompok _____________________________________ http://www.lpsdimataram.com Volume 8, No. 5, Agugstus 2014 32 Media Bina Ilmiah perlakuan 1 rata-rata hasil pemeriksaan kadar kolesterol setelah pemberian filtrat daun bayam hijau selama 9 hari adalah 174,8 mg/dl menunjukkan terjadi penurunan kadar kolesterol sebesar 24 mg/dl dengan kisaran penurunan 12%, sedangkan pada kelompok perlakuan 2 rata-rata hasil pemeriksaan kadar kolesterol setelah pemberian filtrat daun bayam merah selama 9 hari adalah 168,8 mg/dl menunjukkan terjadi penurunan kadar kolesterol sebesar 16,2 mg/dl dengan kisaran penurunan 8,7%. Penelitian ini diperkuat oleh penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh (Nugroho, 2013) tentang efek ekstrak metanol daun bayam (Amaranthus sp) terhadap kadar kolesterol tikus (Rattus norvegiccus galur Wistar) yang diberi diet aterogenik. Berdasarkan penelitian yang dilakukan, pemberian ekstrak metanol daun bayam berpengaruh terhadap penurunan kadar kolesterol total tikus sampel sebesar 8 % (Nugroho, 2013). Dari hasil diatas, menunjukkan penurunan kolesterol yang diberi filtrat daun bayam lebih besar dibandingkan dengan pemberian ekstrak methanol daun bayam. Hal tersebut bisa terjadi karena disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu pemberian dosis ekstrak yang belum optimal untuk menurunkan kolesterol pada hewan coba. Selain itu, proses pembuatan ekstrak yang kurang tepat bisa mengurangi konsentrasi ekstrak yang diberikan pada sampel. Dan juga, penggunaan ekstrak methanol daun bayam bertujuan untuk mengambil kandungan-kandungan tertentu pada daun bayam, tidak seperti filtrat yang masih memiliki seluruh kandungan dari daun bayam tersebut. Bayam memiliki berbagai macam kandungan yang bisa membantu menurunkan kolesterol seperti lutein dan vitamin C. Bayam mengandung karotenoid yang dikenal sebagai lutein yang membantu untuk mencegah penumpukan kolesterol dalam sistem peredaran darah (Murtopo, 2013), dan juga mengandung vitamin C yang dapat menurunkan kadar kolesterol dalam darah. Mekanisme kerja vitamin C dalam menurunkan kadar kolesterol adalah dengan cara penghambatan terhadap HMG-CoA reduktase yang berfungsi sebagai pengkatalis dalam pembentukan kolesterol dan meningkatkan aktivitas Lechitin Cholesterol Acyl Transferase (LCAT). Mekanisme _____________________________________________ Volume 8, No. 5, Agustus 2014 ISSN No. 1978-3787 ini serupa dengan mekanisme kerja obat statin yang memblokir HMG-CoA menjadi asam mevaloat (Williams, 2008). Selain itu, bayam juga memiliki berbagai macam kandungan zat aktif diantaranya saponin, skualen dan flavonoid (Kabiri dkk, 2010). Saponin dalam ekstrak bayam dapat berinteraksi langsung dengan kolesterol membentuk molekul yang tidak larut air yang nantinya akan menghambat penyerapan kolesterol. Selain itu, saponin juga berpengaruh terhadap metabolisme kolesterol secara tidak langsung yaitu dengan berikatan dengan asam empedu dan meningkatkan ekskresi fekal dari asam empedu tersebut sehingga berakibat semakin sedikitnya asam empedu yang mengalami siklus enterohepatik. Berkurangnya asam empedu dalam siklus enterohepatik memicu hati untuk menggunakan kolesterolnya membentuk asam empedu baru (Sidhu & Oakenfull, 1990; Francis dkk, 2002). Selain itu juga ada skualen yang dapat menghambat aktifitas enzim HMG-CoA reduktase yang merupakan enzim yang berperan penting dalam sintesis kolesterol (Escudero dkk, 2006) serta flavonoid yang dapat menurunkan sekresi apo B dalam hepatosit dan juga menurunkan aktifitas dari enzim HMG-CoA reduktase (Guyton & Hall, 2006). Dari hasil uji statistik Paired Sample Test pada perlakuan 1 yang diberi filtrat daun bayam hijau di dapatkan nilai p = 0,017 < α = 0,05 artinya H0 ditolak dan Ha diterima, artinya ada pengaruh pemberian filtrat daun bayam hijau (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar. Pada data perlakuan 2 menunjukkan nilai p = 0,006< α = 0,05 artinya H0 ditolak dan Ha diterima, artinya ada pengaruh pemberian filtrat daun bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar. Hasil uji statistik selanjutnya dengan uji Independent Sample Test yang bertujuan untuk mengetahui perbedaan kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diberikan filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) menunjukkan nilai p = 0,368> α = 0,05 artinya H0 diterima, artinya tidak ada perbedaan efektifitas pemberian filtrat http://www.lpsdimataram.com ISSN No. 1978-3787 daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar. Dari hasil penelitian menunjukkan ada perbedaan penurunan kadar kolesterol pada hewan coba tikus putih yang diberi filtrat daun bayam hijau dan bayam merah, akan tetapi menurut hasil uji statistik menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan antara hewan coba yang diberi filtrat daun bayam. PENUTUP a. Simpulan Simpulan dari penelitian ini adalah : 1. Rata-rata kadar kolesterol pada hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar setelah pemberian diet hyperlipid adalah 198,8 mg/dl pada perlakuan 1 dan 185 mg/dl pada perlakuan 2. 2. Rata-rata kadar kolesterol pada hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar setelah pemberian filtrat daun bayam hijau adalah 174,8 mg/dl. 3. Rata-rata kadar kolesterol pada hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar setelah pemberian filtrat daun bayam merah adalah 168,8 mg/dl. 4. Ada pengaruh pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar. 5. Tidak ada perbedaan efektifitas pemberian filtrat daun bayam hijau dan bayam merah (Amaranthus tricolor L) terhadap kadar kolesterol darah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar. b. Saran 1. Untuk masyarakat atau penderita hiperkolesterolemia dapat menggunakan obat alternatif yaitu sayur bayam karena dapat membantu menurunkan kadar kolesterol darah. Untuk penelitian mendatang perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kadar asam urat pada hewan coba akibat pemberian bayam. 2. Media Bina Ilmiah33 DAFTAR PUSTAKA Adik M. 2009. Kupas Tuntas Kolesterol. Dianloka Printika. Yogyakarta. Bangun, 2006. Terapi Jus dan Ramuan Tradisional untuk Kolesterol. PT. AgroMedia Pustaka. Jakarta Escudero, N.L; Zirulnik F; Gomez N.N; Mucciarelli S.I; Gimenez M.S. 2006. Influence of a Protein Concentrate from Amaranthus cruentus Seeds on Lipid Metabolism. Exp Biol Med 231:50-9 PubMed, Web of Science. Fauziah & Sapta. 2009. Sayur dan Bumbu Dapur Berkhasiat Obat. Penebar Swadaya. Jakrta. Francis G; Kerem Z; Makkar H.P.S; Becker K. 2002. The biological action of saponins in animal systems: a review. Guyton A.C. & Hall, J.E. 2006. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Penerbit buku kedokteran ECG. Jakarta. Hanafiah, K. A. 1997. Rancangan Percobaan Teori dan Aplikasi. PT. Raja Grafindo. Jakarta Harmita & Maksum. 2008. Buku Ajar Analisis Hayati. Kedokteran EGC. Jakarta. Kabiri N; Asgary S; Madani H; Mahzouni P. 2010. Effect of Amaranthus caudatus L. Extract and lovastatin on Atherosclerosis in Hypercholesterolemic Rabbits. Liza, 2013. Manfaat Sayur Bayam Bagi Kesehatan. http://www.pagaralamkota.go.id/index.ph p?option=com_content&view=article&i d=860:9-manfaat-sayur-bayam-bagikesehatan&catid=56:artikel. Diakses 10 Januari 2014. Murtopo, 2013. cauchymurtopo.wordpress.com/tag/menu runkan-kolesterol/. Diakses 7 Januari 2014. _____________________________________ http://www.lpsdimataram.com Volume 8, No. 5, Agugstus 2014 34 Media Bina Ilmiah ISSN No. 1978-3787 Nilawati, Krisnatuti, Mahendra dan Gin Djing. 2008. Care Yourself, Kolesterol. Penebar Plus. Jakarta. Penyakit Jantung Koroner pada Kelompok Usia ≤ 45 Tahun. Universitas diponegoro semarang. Notoatmodjo, Soekidjo. 2005. Metodologi Penelitian Kesehatan. Raja Grafino Persada. Jakarta. Tirtawinata, Tien. 2006. Makanan Dalam Perspektif Al-Quran dan Ilmu Gizi. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta. Nugroho, Tito R. 2013. Efek Ekstrak Metanol Daun Bayam (Amaranthus sp) terhadap Kadar Kolesterol Tikus (Rattus norvegicus galur Wistar) yang diberi Diet Aterogenik. Fakultas kedokteran Universitas Brawijaya. Rukmana, Rahmat. 1994. Bayam, Bertanam & Pengolahan Pascapanen. Kanisius. Yogyakarta. Sidhu G.S. & Oakenfull, S.G. 1990. A mechanism for the Hypercholesterolemic activity of saponins. British Journal of Nutrition. Soeharto, Iman. 2004. Serangan Jantung dan Stroke Hubungannya dengan Lemak & Kolesterol. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Soenardi, Tuti. 1995. Menu Rendah Kolesterol Untuk Kesehatan Jantung. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Sulihandari. 2013.Herbal, Sayur & Buah Ajaib : Koleksi Bahan Alami nan Ajaib untuk Hidup Sehat Jauh dari Penyakit. Trans Idea Publishing. Jogjakarta. Uripi, Vera. 2003. Menghidangkan Menu Rendah Kolesterol. Puspa Swara. Jakarta. Wirakusumah, Emma S. 2000. Buah dan Sayur Untuk Terapi. Penebar Swadaya. Jakarta. Wirakusumah, Emma S. 2007. Jus Buah dan Sayuran. Jakarta: Penebar Swadaya. Jakarta. Wordpress, 2010. http://dokterternak.wordpress.com/2010/ 11/05/jenis-dan-ciri-ciri-tikuslaboratorium-disertai-gamba/. Diakses 5 Maret 2014 Yahya. 2010. Menaklukkan Pembunuh No.1 : Mencegah dan Mengatasi Penyakit Jantung Koroner Secara Tepat dan Cepat. Penerbit Qanita. Bandung. Yatim, Faisal. 2005. Jantung Koroner, Stroke, Meninggal mendadak Atasi dengan Pola Hidup Sehat. Pustaka Populer Obor. Jakarta. Zainuddin, Muhamad. 2000. Penelitian. Surabaya. Supriyono, Mamat. 2008. Faktor-Faktor Risiko yang Berpengaruh Terhadap Kejadian _____________________________________________ Volume 8, No. 5, Agustus 2014 http://www.lpsdimataram.com Metodelogi