Isi Protein I
advertisement
Laporan Praktikum Biokimia Hari/ tanggal Waktu PJP Asisten : Selasa, 24 September 2013 : 13.00-14.40 WIB : Puspa Julistia Puspita, S. Si, M. Sc. : Resti Siti Muthmainah, S. Si. Lusianawati, S. Si. PROTEIN I Kelompok 7 Ayu Septra Wulandari Yaya Nugraha Diana Agustini Raharja J3L112029 J3L112089 J3L112168 PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013 Pendahuluan Menurut Hart (2003), protein berasal dari kata protos. Protos memiliki arti, yaitu utama. Protein merupakan senyawa organik kompleks yang memiliki berat molekul yang tinggi dan merupakan polimer yang terdiri dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Menurut Lehninger (1982), struktur umum asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. gugus α-amino NH 2 CO 2H C H variasi struktur terjadi R dalam rantai samping Gambar 1 Struktur molekul asam amino (Fessenden 1986) Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus terebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang mencirikan gugus-gugusnya. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat. Protein terbentuk dari beberapa asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Peptida merupakan oligomer dari asam amino yang memainkan peran penting dalam banyak proses biologis. H2N H O C C R1 H NH ikatan peptida O C OH R2 Gambar 2 Ikatan peptida antar asam amino dalam membentuk protein Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya. Berdasarkan gugus sampingnya hidrogen adalah glisina. Gugus samping alkil terdiri dari alanina, valina, leusina, isoleusina, dan prolina. Fenilalanina, tirosina, serta triptofan didasarkan pada gugus samping yang dimiliki adalah aromatik. Untuk gugus samping yang mengandung alkohol, di antaranya serina dan treonina. Gugus samping basa, yaitu lisina, arginina, dan histidina sedangkan untuk gugus samping berupa asam, yaitu asam aspartat dan asam glutamat. Sedangkan untuk gugus samping amida, yaitu asparagina dan glutamina dan untuk gugus samping yang mengandung sulfur, yaitu sisteina dan metionina. Dari ke-20 asam amino yang ada, terdapat sembilan macam asam amino esensial, yaitu leusina, isoleusina, fenilalanina, triptofan, treonina, lisina, arginine, histidina, dan metionina. Asam amino esensial ini tidak dapat disintesis oleh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya. Tujuan Praktikum dilakukan untuk mengidentifikasi sifat dan struktur asam amino dan protein melalui uji-uji kualitatif, yaitu uji Millon, uji ninhidrin, uji belerang, uji Xantoproteat, dan uji biuret. Metode Bahan-bahan yang digunakan, di antaranya albumin 2% dan 0,002%, gelatin 2% dan 0,002%, kasein 2% dan 0,002%, pepton 2% dan 0,002%, serta fenol 2% dan 0,002%, pereaksi Millon, pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat pekat, pereaksi ninhidrin, NaOH 10% dan pekat, Pb-asetat 5%, HNO3 pekat, CuSO4 0,1%, serta akuades. Alat-alat yang digunakan adalah penangas air dan alat-alat gelas. Uji Millon dilakukan dengan cara ke dalam 3 mL larutan protein ditambahkan 5 tetes pereaksi Millon. Larutan protein yang diuji adalah albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%. Campuran larutan protein dengan pereaksi Millon dipanaskan baik-baik. Jika peeaksi yang digunakan terlalu banyak maka warna akan hilang pada pemanasan. Uji ninhidrin dilakukan dengan cara ke dalam 3 mL larutan protein ditambahkan 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1%. Kemudian, campuran ini dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 10 menit. Perubahan warna yang terjadi diperhatikan. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin 0,02%, gelatin 0,02%, kasein 0,02%, pepton 0,02%, dan fenol 0,02%. Uji belerang dilakukan dengan cara ke dalam 2 mL larutan protein ditambahkan 5 mL NaOH 10%. Kemudian, campuran dididihkan selama beberapa menit dan ditambahkan 2 tetes larutan Pb-asetat 5%. Pemanasan dilanjutkan beberapa menit dan warna yang terjadi diamati. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin 0,02%, gelatin 0,02%, kasein 0,02%, pepton 0,02%, dan fenol 0,02%. Uji Xantoproteat dilakukan dengan cara ke dalam 2 mL larutan protein ditambahkan 1 mL HNO3 pekat, dicampurkan baik-baik, dan dipanaskan dengan hati-hati. Warna kuning tua yang terbentuk diamati. Kemudian, tabung didinginkan dan ditambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat sampai larutan menjadi basa. Perubahan warna yang terjadi diamati. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%. Uji biuret dilakukan dengan cara ke dalam 3 mL larutan protein, yaitu albumin, gelatin, kasein, pepton, dan fenol ditambahkan 1 mL NaOH 10% dan ditambahkan 1 tetes larutan CuSO4 0,1%. Campuran ini dikocok dan apabila tidak timbul warna maka ditambahkan CuSO4 lagi. Hasil dan Pembahasan Keistimewaan dari protein adalah strukturnya yang mengandung N, selain C, H, O, S, dan kadang-kadang P, Fe, dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan protein). Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh asamasam amino. Albumin adalah protein terpenting yang disintesis oleh hati. Albumin merupakan unsur utama yang terdapat pada putih telur dan mengandung 584 asam amino. Gelatin ialah protein hewani yang diambil dari jaringan hewan, seperti tulang dan jaringan ligamen. Kasein merupakan senyawa fosfogliko protein berbentuk misel. Kasein mengandung lisina, kekurangan sisteina, tetapi kaya akan metionina dan dapat dihidrolisis menjadi oligopeptida yang larut dan mudah dicerna. Fenol merupakan senyawa aromatik dengan satu atau beberapa gugus hidroksil yang terikat secara langsung pada cincin benzena. Protein derivat merupakan hasil pemecahan protein alam sebelum menjadi asam α-amino. Pemecahan protein umumnya melalui hidrolisis. Hidrolisis berat diperoleh protein derivat sekunder, salah satunya ialah pepton. Pepton ikut larut dalam air dan tak menggumpal apabila dipanaskan. Tabel 1 Hasil uji Millon Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Albumin Gelatin Kasein Pepton Fenol + Keterangan: (+) = mengandung tirosin Perubahan warna larutan Kuning Tidak berwarna Tidak berwarna Tidak berwarna Jingga (-) = tidak mengandung tirosin Gambar 3 Hasil uji Millon pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d), dan fenol (e) Menurut Poedjiadi (1994), prinsip dari uji Millon adalah ternitrasinya tirosin membentuk garam merkuri yang berwarna merah. Pereaksi Millon berisi merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Fungsi uji Millon adalah untuk membuktikan adanya tirosin yang terkandung dalam suatu protein. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Hasil percobaan tidak sesuai dengan literatur. Menurut literatur, selain fenol, albumin dan kasein juga positif dalam uji ini karena tirosin memiliki molekul fenol pada gugus alkilnya dan albumin serta kasein mengandung tirosin sebagai salah satu asam penyusunnya. Gambar 4 Reaksi yang terjadi pada uji Millon Uji Hopkins-Cole tidak dilakukan pada percobaan, akan tetapi prinsip dari uji Hopkins-Cole, yaitu berdasarkan adanya triptofan dalam molekul protein. Triptofan mudah sekali berkondensasi dengan aldehida bila ada asam kuat, sehingga membentuk senyawa berwarna. Pereaksi ini mengandung asam glioksilat. Fungsi uji Hopkins-Cole, yaitu untuk membuktikan adanya gugus indol dalam protein atau triptofan dalam molekul protein. Menurut literatur, hasil positif (membentuk cincin ungu) diberikan oleh larutan uji , yaitu albumin dan kasein. H CH2 CH2 CO 2H HC + HC N H O CO 2H O N H H asam glioksilat triptofan H NH H asam 2,3,4,5,tetrahidro-karbolin-4-karboksilat Gambar 5 Reaksi yang terjadi pada uji Hopkins-Cole Tabel 2 Hasil uji ninhidrin Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutan Albumin + Biru ungu Gelatin Tidak berwarna Kasein Tidak berwarna Pepton + Biru ungu Fenol Tidak berwarna Keterangan: (+) = mengandung asam amino bebas (-) = tidak mengandung asam amino bebas Gambar 6 Hasil uji Ninhidrin pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d), dan fenol (e) Prinsip dari uji ninhidrin yaitu semua asam amino atau peptida yang mengandung asam α-amino bebas dan sedikitnya satu gugus hidroksil akan bereaksi dengan ninhidrin (triketohidrindenahidrat) membentuk senyawa kompleks berwarna biru ungu. Namun, prolin dan hidroksi prolin menghasilkan senyawa berwarna kuning. Fungsi dari uji ninhidrin adalah untuk membuktikan adanya asam amino bebas dalam protein. Uji ini umum sifatnya karena semua protein mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus amino bebas (asam α-amino). Hasil percobaan kurang sesuai dengan literatur. Hasil positif seharusnya ditunjukkan pula pada gelatin dan kasein selain pada albumin dan pepton. Albumin, gelatin, dan pepton membentuk warna biru ungu karena mempunyai gugus asam amino bebas dan kasein menunjukkan warna kuning karena mengandung gugus prolin atau hidroksiprolin. O C CO 2H R H + NH2 asam amino OH C C O O O C C C OH C O ninhidrin N + H+ HC CH biru O - + 3H2O + CO 2+ R O C H Gambar 7 Reaksi yang terjadi pada uji ninhidrin Tabel 3 Hasil uji belerang Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutan Albumin + Cokelat kehitaman Gelatin Tidak berwarna Kasein Kuning Pepton Tidak berwarna Fenol Tidak berwarna Keterangan: (+) = mengandung sisteina atau metionina (-) = tidak mengandung sisteina dan metionina Gambar 8 Hasil uji belerang pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d), dan fenol (e) Prinsip uji belerang adalah dalam larutan basa, yang berasal dari sisteina atau metionina akan bereaksi dengan Pb-asestat membentuk garam PbS yang berwarna hitam. Fungsi uji belerang adalah membuktikan adanya asam amino yang mengandung gugus samping sulfur. Sisteina dan metionina merupakan asam amino yang mengandung S pada molekulnya. Reaksi Pb-asetat dengan asam amino tersebut akan membentuk endapan berwarna hitam atau kelabu. Penambahan NaOH dalam percobaan tersebut ialah untuk mendenaturasi protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat dan membentuk garam PbS. Menurut literatur, tidak hanya albumin yang menunjukkan hasil positif tetapi juga kasein dengan warna yang terbentuk berupa kuning gelap. O NH HC NH O C NH CH 2SH oksidasi CH 2SH reduksi CH C CH H2C H2C NH CH O 2 residu sisteina C S S ikatan disulfida C O residu sistina Gambar 9 Reaksi yang terjadi pada uji belerang Tabel 4 Hasil uji Xantoproteat Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutan Albumin + Jingga Gelatin Tidak berwarna Kasein Tidak berwarna Pepton Kuning muda Fenol + Jingga Keterangan: (+) = asam amino mengandung inti benzena (-) = asam amino tidak mengandung inti benzena Gambar 10 Hasil uji Xantoproteat pada albumin (a), gelatin (b), kasein (c), pepton (d), dan fenol (e) Menurut Yazid (2006), prinsip uji Xantoproteat didasarkan pada nitrasi inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Jika protein yang mengandung cincin benzena (tirosin, triptofan, dan fenilalanin) ditambahkan asam nitrat pekat, maka akan terbentuk endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning tua sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya berubah menjadi jingga. Fungsi untuk uji ini merupakan uji khas untuk asam-asam amino yang mengandung inti benzena. Hasil percobaan kurang sesuai dengan literatur. Menurut literatur, albumin, kasein, gelatin, pepton dan fenol seluruhnya menunjukkan hasil yang positif karena semua bahan mengandung inti benzena pada molekulnya. NH HO NH + CH2 CH C HNO 3 HO O + CH2 CH O 2N C H2O O tirosin ternitrasi (kuning tua) tirosin dalam protein Gambar 11 Reaksi yang terjadi pada uji Xantoproteat Tabel 5 Hasil uji biuret Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutan Albumin + (7 tetes) Ungu Gelatin + (7 tetes) Ungu Kasein - (12 tetes) Tidak berwarna Pepton - (35 tetes) Biru Fenol - (27 tetes) Biru Keterangan: (+) = mengandung molekul peptida dari protein (-) = tidak mengandung molekul peptida dari protein Gambar 12 Hasil uji biuret pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d), dan fenol (e) Prinsip uji biuret, yaitu ion Cu2+ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu (violet). Reaksi biuret positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida, yaitu dipeptida dari asam-asam amino histidin, serin, dan treonin. Reaksi pun positif terhadap senyawa-senyawa yang mengandung dua gugus: -CH2NH2, -CSNH2, -C(NH)NH2, dan –CONH2. Fungsi dari uji biuret adalah untuk membuktikan adanya molekul-molekul peptida dari protein. Hasil percobaan tidak sesuai dengan literatur. Menurut literatur albumin, gelatin, kasein dan pepton memberikan hasil yang positif. Sedangkan fenol tidak bereaksi dengan pereaksi biuret. Hal ini disebabkan albumin, kasein, pepton dan kasein merupakan asam amino yang memiliki ikatan peptida sedangkan fenol tidak termasuk ke dalam golongan asam amino sehingga tidak memiliki ikatan peptida dan bereaksi negatif terhadap uji biuret. Gambar 13 Reaksi yang terjadi pada uji biuret Pemanasan dilakukan pada uji Millon, ninhidrin, belerang, dan uji Xantoproteat adalah untuk mempercepat laju reaksi. Banyaknya hasil percobaan yang tidak sesuai dengan literatur dapat disebabkan oleh pereaksi atau bahan uji yang digunakan sudah tidak dalam keadaan segar lagi atau terlalu lama disimpan sehingga kurang reaktif. Aplikasi uji-uji kualitatif protein dan asam amino ini salah satunya adalah untuk menganalisis kandungan suatu produk. Uji Millon untuk analisis tirosin. Uji Hopkins-Cole untuk analisis triptofan. Uji ninhidrin termasuk yang paling umum dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya. Reaksi ninhidrin dapat pula dilakukan terhadap urin untuk mengetahui adanya asam amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein oleh cairan tubuh. Sedangkan untuk uji belerang yang dapat membentuk ikatan disulfida pada sisteina atau metionina penerapannya dapat berupa pengeritingan dan pelurusan rambut. Uji Xantoproteat untuk analisis asam amino tirosina, triptofan dan fenilalanina yang terdapat dalam suatu produk yang mengandung protein. Pada uji biuret digunakan untuk analisis molekul peptida dari protein. Simpulan Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa ada uji Millon, fenol memberikan hasil yang positif yang mana albumin dan kasein juga seharusnya memberikan hasil positif. Pada uji ninhidrin, albumin dan pepton memberikan hasil positif yang mana kasein dan gelatin juga seharusnya memberikan hasil positif. Pada uji belerang, albumin memberikan hasil positif yang mana kasein juga seharusnya memberikan hasil positif. Sedangkan pada uji Xantoproteat, albumin dan fenol memberikan hasil yang positif yang seharusnya gelatin, pepton, dan kasein juga memberikan hasil yang positif. Untuk uji biuret, albumin dan gelatin memberikan hasil positif yang seharusnya kasein dan pepton juga memberikan hasil positif. Daftar Pustaka Fessenden RJ, JS Fessenden. 1986. Kimia Organik. Jilid ke-2. Pudjaatmaka AH, penerjemah; Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Ed. ke-3. Hart Harold, LE Craine, DJ Hart. 2003. Kimia Organik. Achmadi SS, penerjemah; Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Ed. ke-11. Lehninger AL. 1982. Dasar- Dasar Biokimia. Maggy T, penerjemah; Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Principle of Biochemistry. Poedjiadi Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Press. Yazid Estien, Lisda Nursanti. 2006. Penuntun Praktikum Biokimia untuk Mahasiswa Analis. Yogyakarta (ID): Andi.
