BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Alat dan Bahan Alat

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah, Sentrifiige SED 5 (United Kingdom),
seperangkat alat Destilasi, alkoholmeter, pH meter merek HANNA, timbangan
analitik merek METTLER AE 200, spektronik D 20, HPLC Shimadzu LC-20AD,
detektor HPLC SPD 20A, printer HP Laser Jet PI005, ultrasonik Branson 3510,
milipore 0,45|jm, kolom Shim-pack VP-ODS 250L x 4,6 (CI8) dan seperangkat
alattitrasi.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah limbah buah nenas,
starter Kombucha, Amonium heptamolybdat-Tetrahydrat ((NH4)6Mo7024.4H20)
Merck, di-natriumhydrogenarsenat-Heptahydrat (Na2HAs04.7H20) Merck, Asam
sulfat
(H2SO4)
delta aldrick. Natrium karbonat anhidrat (Na2C03) Unilab, asam
oksalat dihidrat
(C2H2O4.2H2O)
Merck, Kaliumnatriimi
tartarat-tetrahydrat
(C4H4KNa06.4H20) Merck, Natrium sulfat (Na2S04) Merck, Natrium hidroksida
(NaOH) Merck, kupri sulfat pentahidrat
(CUSO4.5H2O)
Merck, Natrium hidrogen
karbonat (NaHCOa) Wako Pure Chemical, glukosa anhidrat, akuabiDestilasi dan
asam asetat standar
(CH3COOH).
3.2. Peremajaan kombucha
Sebelum digunakan sebagai starter maka dilakukan peremajaan terhadap
kombucha dengan cara mendidihkan air sebanyak I L , gula sebanyak 100 gram
dicampur dengan baik dan didihkan kembali selama 5 menit, teh dicelupkan pada
larutan. Larutan dipindahkan dalam wadah kaca dan dinginkan. Setelah larutan
teh dingin kemudian masukkan koloni kombucha yang telah ada sebelumnya dan
ditutup dengan kain kasa. Inkubasi selama 10 hari maka akan terbentuk lapisan
baru dari koloni kombucha yang dapat kita gunakan untuk penelitian selanjutaya
(semakin lama inkubasi maka semakin tebal lapisan kombucha yang kita dapat).
11
Gambar 5. Kombucha
3.3. Teknik pengambilan dan persiapan sampel
Sampel limbah buah nenas diambil dari usaha keripik nenas PRIMA TANI
di Jl.raya Pekanbaru Bangkinang KM26 Kualu Nenas Kecamatan Tambang
Kabupaten Kampar. Sampel (empulur, kulit dan limbah daging) dibersihkan dari
kotoran, kemudian homogenkan, dan diblender sehingga didapat jus limbah buah
nenas. Air teh dipersiapkan dengan cara melarutkan 100 gram gula dalam 1 L air
mendidih dan the dicelupkan pada larutan. Persiapan sampel ini dapat langsung
digunakan untuk percobaan pada tahap I .
Kulit
Empelur
Limbah daging
Gambar 6. Jenis sampel limbah nenas yang dianalisis
3.4. Rancangan Penelitian
Tahap I:
Menentukan kandungan gula pereduksi dari limbah buah nenas dan
larutan air teh menggunakan metode Nelson Somogyi.
Tahap II:
Menentukan kandungan substrat optimal yang dilakukan pada variasi
, :
substrat 25%, 50%, 75% dan 100% (w/v) dengan menggunakan berat
starter konstan 25 gram dan difermentasi selama dua hari,
optimalisasi ditandai dengan kadimgan alkohol optimal yang diukur
V
menggunakan alkoholmeter.
Tahap III: Menentukan berat starter optimal yang dilakukan pada variasi 15
gram, 25 gram, 35 gram, 45 gram dan 55 gram dengan menggunakan
kandimgan substrat optimal dan difermentasi selama dua hari,
optimalisasi ditandai dengan kandungan alkohol optimal yang diukur
menggunakan alkoholmeter.
Tahap IV: Menentukan waktu fermentasi optimal untuk asam asetat yang
dilakukan pada variasi fermentasi selama 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dan 11
hari dengan substrat dan berat starter optimal yang telah didapatkan
pada tahap sebelumnya, optimalisasi ditandai dengan menentukan
?
kadar asam asetat menggunakan metode titrasi dan HPLC.
3.5. Prosedur Penelitian
3.5.L Tahap I (Penetapan Gula Pereduksi)
A. Penentuan waktu kestabilan wama
Waktu kestabilan wama ditentukan menggimakan larutan standar glukosa
anhidrat dengan konsentrasi 30 ppm yang dipipet sebanyak 1 mL. Reagen Nelsonsomogyi ditambahkan sebanyak 1 mL dan selama 20 menit larutan dipanaskan di
atas penangas air. Tabung diangkat dan dinginkan hingga suhu 24*'C. Reagen
arsenomolibdat sebanyak 1 mL ditambahkan, dikocok sampai endapan CU2O larut
kembali. Aquades ditambahkan kembali 7 mL. Absorbansi larutan ditentukan
mulai dari 0 menit sampai 80 menit dengan interval waktu 5 menit pada panjang
gelompang 660 nm, sehingga kestabilan wama dapat diketahui dari kurva antara
absorbansi dengan waktu pengukuran.
B. Penentuan panjang gelombang optimum
Panjang gelombang optimum ditentukan menggunkan larutan standar
glukosa anhidrat dengan konsentrasi 30 ppm yang dipipet sebanyak 1 mL. Reagen
Nelson-somogyi ditambahkan sebanyak 1 mL dan selama 20 menit dipanaskan di
atas penangas air. Tabung diangkat dan dinginkan hingga suhu 24°C. Reagen
arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL, larutan dikocok sampai endapan
CU2O
larut kembali. Aquades ditambahkan kembali 7 mL. Untuk panjang
gelombang optimimi dapat diketahui dengan pengukuran absorbansi pada panjang
gelombang 600-900 nm dengan interval 10 run. Pengukuran dilakukan selama
waktu kestabilan wama tercapai.
19
C. Pembuatan kurva standar
Standar yang digunakan adalah glukosa anhidrat yang ditimbang sebanyak
0,2503 gram dalam 250 mL aquades (larutan induk). Larutan induk diambil 10
mL yang kemudian diencerakan sampai volume 100 mL dengan aquades (larutan
intermediet). Larutan intermediet digimakan untuk membuat deretan larutang
standar dengan masing-masing diambil 5, 10, 15, 20, 25, 30 dan 40 mL dan
masing-masingnya ditambahkan aquades sampai volume 50 mL. Deretan larutan
standar diambil 1 mL masing-masingnya dan dimasukkan dalam tabung reaksi.
Reagen Nelson-somogyi ditambahkan sebanyak 1 mL dan larutan dipanaskan
selama 20 menit di atas penangas air. Tabung diangkat dan dinginkan hingga suhu
24*'C. Reagen arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL, larutan dikocok
sampai endapan CuiO larut kembali. Aquades ditambahkan kembali 7 mL, larutan
didiamkan selama 10 menit. Absorbansinya larutan ditentukan pada panjang
gelombang 760 nm.
D. Penetapan sampel
Larutan air teh dan sampel jus limbah buah nenas ditimbang kemudian
filtratnya diambil sebanyak 10 mL. Filtrat disentrifiis selama 10 menit dengan
kecepatan 2000 rpm. Ekstrak yang didapat diambil 5 mL kemudian dilarutkan
kembali sampai volume 100 mL dengan aguades, hasil pengenceran ini dipipet
1 mL dan diencerkan kembali sampai volume 100 mL. Filtrat pengenceran ini
ditentukan kadamya gula sama seperti standar.
3.5.2. Tahap II (Penetapan kandungan substrat optimal)
A. Persiapan substrat
Sampel limbah nenas (empulur, kulit dan limbah daging) ditimbang
masing-masing 300 gram, dengan penambahan air 900 mL campuran sampel
diblender hingga halus dan dipanaskan selama 10 menit (lakukan dua kali
pengulangan). Jus limbah buah nenas diambil masing - masing sebanyak
250 gram, 500 gram, 750 gram dan 1000 gram dan dimasukkan dalam wadah
kaca . Air yang telah didihkan terlebih dahulu ditambahkan sampai volume
larutan 1000 mL sehingga diperoleh kandungan secara berurut 25%, 50%, 75%
dan 100% (wA').
> .
20
,,
B. Penetapan
Starter sebanyak 25 gram ditimbang, pada masing-masing variasi
kandungan sampel di dalam wadah kaca dimasukkan starter, kemudian larutan
ditutup dengan kain kasa. Larutan diinkubasi pada suhu 24*'C- 34°C selama 2 hari.
Setelah 2 hari larutan didestilasi, dan kandungan alkohol ditentukan menggunakan
alkoholmeter. Kandungan sampel optimal ditunjukkan dengan hasil pengukuran
kandungan maksimal dari alkohol.
3.5.3. Tahap III (Penetapan berat starter optimal)
Substrat dengan kandungan optimal yang didapat dimasukkan dalam empat
wadah kaca masing-masing 1 L. Lima variasi berat starter kombucha ditimbang
masing-masing 15, 25, 35, 45 dan 55 gram kemudian dimasukkan dalam wadah
kaca dan ditutup dengan kain kasa. Larutan dinkubasi pada suhu 24*^C- 34°C
selama 2 hari. Setelah 2 hari larutan didestilasi, dan kandungan alkoholnya
ditentukan menggunakan alkoholmeter. Kandungan starter optimal ditunjukkan
dengan hasil pengukuran kandungan optimal dari alkohol.
3.5.4. Tahap IV (Penetapan waktu optimal pembentukan asam asetat)
Penentuan waktu optimal dilakukan dengan cara menggunakan kandungan
substrat optimal dan kandungan starter optimal yang telah didapat sebelumnya.
Substrat dimasukkan dalam wadah kaca. Starter Kombucha dimasukkan dan
larutan ditutup dengan kain kasa. Larutan diinkubasi pada suhu 24°C- 34°C
dengan variasi waktu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 dan 11 hari.
Setelah waktu fermentasi selesai, tutup wadah yang berisi sampel tadi
dibuka. Nata kombucha baru yang terbentuk selama fermentasi dipisahkan dari
larutan. Larutan hasil fermentasi disaring menggunakan kertas whatman no 42.
Filtrat dimasukkan pada wadah yang tertutup rapat dan disimpan di refrigerator.
Kadar asam asetat ditentukan secara titrimetri dan HPLC pada setiap variasi
waktu. Kadar yang tertinggi dari asam asetat adalah sebagai waktu optimum yang
digunakan untuk fermentasi asam asetat.
3.5.4.1. Penentuan asam asetat dengan metode titrasi
Hasil fermentasi dipipet sebanyak 10 mL, kemudian dimasukkan dalam
labu 100 mL, larutan dipaskan sampai tanda batas dengan akuades. Larutan
21
dipipet sebanyak 10 mL dan diencerkan sampai volvmie 250 mL. Larutan hasil
pengenceran sebanyak 10 mL dititrasi dengan larutan standar NaOH 0,1 N
menggunakan indikatir phenol ptalein 1-3 tetes.
3.5.4.2. Penentuan asam asetat dengan metode HPLC
Kandungan asam asetat pada sampel dianalisis di BPOM Manado. Kolom
yang digunakan adalah Shim-pack VP-ODS 250Lx4,6 (CI8) dengan panjang
gelombang detektor 214 nm. Volume injeksi 20 ^ l , sistim yang digunakan elusi
isokratik dengan fase gerak aquabides dan kecepatan alir 1,5 ml/menit. Pembuatan
kurva standar dilakukan dengan cara memipet 10 ml asam asetat p.a 100%
kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml (larutan induk). Aquabides
ditambahkan sampai tepat tanda batas. Deretan larutan standar 0,1%, 0,2%, 0,4%,
0,6%, 0,8%, 1,0% dibuat dari larutan induk, kemudian larutan disonikasi/degas
selama 15menit dengan ultrasonik dan diinjeksikan ke HPLC. Kurva standar
didapat dengan cara memplotkan konsentrasi deretan standar dengan luas area
kromatogram masing-masing standar.
Pengukuran sampel dilakukan dengan cara memipet 2 ml sampel hasil
fermentasi, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml dan diencerkan
dengan aquabides tepat sampai tanda batas. Larutan sampel yang telah diencerkan
disaring dengan milipore 0,45 fxm kemudian disonikasi/degas selama 15 menit
dan diinjeksikan ke HPLC. Kandimgan asam asetat dari sampel dapat dihitvmg
berdasarkan kurva standar.
3.5.5. Analisis Data
Data hasil pengukuran yang diperoleh dianalisis secara deskriptif melalui
tabel dan grafik.
22