uji daya hidup dan kemurnian bakteri yang diawetkan dengan

Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
UJI DAYA HIDUP DAN KEMURNIAN BAKTERI YANG DIAWETKAN
DENGAN METODE KERING BEKU
AGUS WAHYUDIN
Balai Besar Penelitian I'eteriner, J1. R .E Alartadinata No . 30 PO BOX 151 Bogor
RINGKASAN
Dalam mempertahankan keberadaan bakteri pada umumnya dilakukan pengawetan . Pada dasarnya sernua
prinsip metode pengawetan adalah sama yaitu memberi penekanan pada faktor-faktor penunjang kegiatan
metabolisme mikroba seperti udara atau gas dan air.
Bakteri Pasteurella multocida, Staphylococcus
epidermidis, Acinetobacter calcolacepticus, Pseudomonas aeroginosa dan Aeromonas hidrophylla yang
diawetkan dengan metode kering beku mampu bertahan dalam penyimpanan selama 16 hingga 22 tahun,
tanpa mengalami perubahan daya hidup demikian juga kemurnian bakteri dapat dipertahankan . Pengawetan
bakteri dengan metode kering beku cukup efektif dan efisien karena mampu mempertahankan daya hidup dan
kemurnian sifat-sifat bakteri serta penanganan hasil awetan tidak memerlukan perlakuan khusus dalam proses
penyimpanan maupun dalam pendistribusian . Metode kering beku yaitu suatu proses penguapan dan
penarikan kadar air dengan sistem sublimasi menggunakan mesin pengering-bekuan (Freeze Drver).
Pengawetan dengan metode ini telah dilakukan di Balitvet Culture Collection dengan menggunakan 7,5%
Glukose dalam Fetal Calf Serum sebagai medium preservan. Produk awetan yang dihasilkan dengan metode
kering beku berada didalam ampul hatppa udara sehingga terlindung dari pencemaran dan aman bagi
Iingkungan sekitarnya .
Kata kunci : Daya hidup, kemurnian . bakteri, pengawetan . pengering bekuan .
PEN DAHULUAN
Berbagai macam metode pengawetan
bakteri banyak dilakukan dan dipilih atas
ketersediaan
dasar
kesukaan,
tujuan,
peralatan serta sumber daya manusia
(SDM) . Dalam menentu-kan metode mi
disamping mempertimhangkan akan
kemampuan
daya tahan awetan juga
mempertahankan sifat-sifat mikroba agar
tidak mutasi . Ada beberapa metode yang
cukup mudah dilakukan seperti metode
pemindah-biakan, tetapi metode ini hanya
cocok untuk tujuan pengawetan dalam
Bakteri dipindah
jangka waktu pendek .
biakkan ke media baru secara periodik
sgsuai dengan daya tahan media selama
beberapa minggu atau bulan (COWAN,
1974) . Disamping mempunyai kelemahan
yaitu mudah terkontaminasi dan besar
kemungkinan terjadi mutasi juga banyak
menyita tenaga dan biaya (SUGIAWAN,
2000) . Metode lain seperti penyimpanan
nitrogen cair cukup menjamin
dalam
terhindarnya dari mutasi mikroba awetan
dapat digunakan
untuk tujuan
dan
atau
lama
pengawetan jangka waktu
tahunan, namun metode ini memerlukan
Pusat Penelittan dan Pengembangan Peternakan
biaya banyak yaitu harus menyediakan
nitrogen cair secara terus menerus .
Pengawetan
metode
pengering
bekuan adalah suatu metode untuk tujuan
pengawetan jangka waktu lama dan sangat
cocok untuk dipakai di laboratorium koleksi
biakan seperti di Balitvet Culture Collection
(BCC) .
Metode ini sangat efektif dan
efisien karena mampu mempertahankan
sifat-sifat bakteri dan penanganan hasil
awetan tidak memerlukan perlakuan khusus .
Metode pengering bekuan adalah suatu
metode yang berteknologi tinggi tetapi
cukup mudah dilaksanakan . Infestasi awal
yaitu pengadaan peralatan mesin pengering
bekuan cukup mahal, tetapi akan dikatakan
hemat bila membandingkan dengan hasil
produksinya .
Dalam makalah ini menerangkan
pengujian terhadap daya hidup bakteri yang
diawetkan dengan metode kering beku yang
disimpan dalam jangka lama dan pasca
proses kering beku, dengan tujuan untuk
membuktikan bahwa metode pengering
bekuan dapat menyimpan bakteri tertentu
dalam jangka lama.
269
Ternu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
MATERI DAN METODE
3.
Materi
Biakan bakteri
Bakteri yang diuji sebanyak 9 biakan,
semua biakan tersebut berasal dari unit
produksi BCC yaitu :
Pasteurella inultocida, sebanyak 5
biakan yang disimpan dalam suhu -20° C .
Staphvlococcus
epidermidis,
sebanyak I biakan yang disimpan dalam
suhu ruangan .
Acinetobacter
calcolacepticus,
sebanyak 1 biakan yang disimpan dalam
suhu ruangan .
Pseudomonas aeroginosa, sebanyak
I biakan yang disimpan dalam suhu
ruangan .
Aeromonas hidrophvlla . s e banyak I
biakan yang disimpan dalam suhu ruangan .
Media
1.
Media Agar darah (AD)
Dibuat dengan menimbang 40 gram
base (Oxoid, lnggris) yang
dilarutkan dalam I liter air suling, lalu di
steril pada suhu 121'C selama 15 menit .
Setelah itu dinginkan hingga mencapai suhu
40°C tambahkan darah domba segar
sebanyak 50 nil, selanjutnya sebanyak 20 ml
dituangkan kedalam cawan petri biarkan
hingga membeku, cawan petri yang berisi
AD disimpan dalam pendingin sebelum
digunakan . Dalam I liter media AD dapat
dibuat sebanyak 50 cawan Petri .
Blood agar
2 . Media
dalam
Preservan
7,5%
Glukosa
Fetal Calf Serum (FCS)
Pertama dibuat larutan 15 gram
Glukose dalam 100 nil air suling lalu disteril
pada suhu 121°C selama 15 menit, setelah
itu didinginkan . Selanjutnya pada larutan
Glukose ditambahkan 100 nil FCS yang
disteril dengan melalui saringan inillipore
berpori 0,22 pm, kemudian dikocok hingga
Campuran larutan
bercampur merata .
tersebut dikemas kedalam botol masingmasing berisi 2 ml, disimpan pada suhu 20°C dan siap digunakan .
Media Serum broth
Pertama kali dibuat yaitu melarutkan
0,80 gram Nutrient broth (Difco, Amerika)
dalam 100 ml air suling lalu disteril pada
suhu 121 ° C selama 15 menit . Selanjutnya
setelah Nutrient broth dingin tambahkan
serum steril sebanyak 5% lalu dikemas
dalam hotel, masing masing botol diisi
sebanyak 2 ml kemudian simpan dalam suhu
5°C dan siap untuk digunakan .
4.
Perangkat
identifikasi
komersial
Api® 20NE(BIOMERIEUX, Perancis)
Perangkat identifikasi
(Kit) ini
berbentuk strip dengan lubang-lubang berisi
bahan kering untuk uji biokimia digunakan
untuk uji bakteri Gram negatip .
5.
NaCI fisiologis
Sebanyak 0,85 gram NaCl (Merck)
dilarutkan dalam 100 ml air suling lalu
dikernas dalam botol masing masing diisi
sebanyak 2 ml . Selanjutnya disteril pada
suhu 12 IT selama 15 menit .
6.
0,5 Mac Farland opacity tube
Pertama kali
dibuat
dengan
melarutkan 100 µl BaC1 2 1% dalam 9,9 ml
H 2 SO 4 I%. Selanjutnya dari larutan tersebut
diambil sebanyak 5 ml lalu ditambahkan
kedalam 5 ml H 2 SO 4 1% aduk hingga
merata, disimpan pada suhu 5 ° C dan siap
digunakan sebagai
standar kekeruhan
suspensi bakteri .
Alat
Biosafety Cabinet Purifier Class 11
(LABCONCO, Amerika) .
Mesin Pengering bekuan (Edwards
Freeze Dryer, lnggris) .
Ampoule
constrictor
(Edwards,
lnggris) .
Tangkai karet berlubang tempat
ampul (LABCONCO, Amerika) .
Pengelas' ampul (Edwards Flame
master hand torch flame, Inggris) .
Vacuum tester (Edwards ST200K
MKII, Inggris) .
Metode
2 70
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Kegiatan dilakukan di laboratorium
unit produksi BCC . Bakteri dalam kemasan
ampul kering beku dicatat identitasnya mulai
dari nomor ampul, tanggal kering beku dan
nama bakteri . Selanjutnya kondisi fisik
ampul diperiksa dan dibersihkan bagian
Iuarnya dengan alkohol 70% . Membuka
ampul dilakukan didalam ruang Biosafety
Cabinet yang benar-benar aman dan secara
hati-hati karena isi ampul hampa udara.
Buat keratan melingkar dengan gergaji
ampul atau kikir dibagian tengah atas
sumbat kapas ampul . Balut ampul dengan
kain kasa (kertas tissue) dibagian yang
dikerat tadi,
lalu ampul dipatahkan .
Sebelum patahan ujung ampul yang runcing
dilepaskan, tunggu sebentar supaya terjadi
keseimbangan tekanan
udara
secara
perlahan-lahan kedalam ampul melewati
penyaringan sumbat kapas . Sumbat kapas
diambil dengan pinset yang steril dan
bersamaan dengan patahan ujung ampul,
dimasukkan
kedalam
bejana berisi
desinfektan . Bagian ampul yang terbuka
didekatkan pada nyala api, kemudian
medium cair Serum broth kira-kira 0,5 ml
kedalam
ampul
segera
dimasukkan
menggunakan pipet pasteur steril . Aduk
dengan baik hingga bakteri tarot dan
usahakan tidak terbentuk gelembung udara .
Suspensi isi ampul dipindahkan kedalam
medium AD yang disiapkan dalam cawan
petri lalu diinkubasikan pada suhu 37 °C
selama 24 jam .
diinkubasi,
bakteri
Setelah
diidentifikasi mulai dari pertumbuhan atau
daya hidup, gambaran koloni, gambaran set
yang dilihat dari basil pewarnaan Grain
(COWAN . 1974) selanjutnya uji reaksi
biokimia . Terhadap bakteri kelompok Gram
negatip dibuat suspensi dengan kekeruhan
mengacu pada 0, 5 Mac Farland opacity tube
lalu diuji reaksi biokimia menggunakan
perangkat uji komersial dengan nama
Api"20NE (BIOMERIEUX, Perancis) dan
terhadap bakteri kelompok Gram positip
diidentitkasi menggunakan metode COWAN
(1974) . bakteri yang berdaya hidup baik
adalah yang mampu turn huh atau hidup pada
media penumbuh awal yaitu media AD .
Kemurnian diuji dengan identitikasi mulai
dari melihat gambaran koloni, reaksi Grain,
bentuk set dan reaksi biokimia hasil yang
Pusat Penelitian clan Pengennbangan Peternakan
diperoleh harus sama atau sesuai dengan
data sebelumnya maka bakteri tersebut
dinilai murni .
Bakteri murni diperbanyak untuk
diawetkan
kembali
dengan
metode
pengering bekuan yang tahapannya mengacu
pada tahapan metode kering beku yang
ditulis
oleh
Sugiawan
(2000)
dan
dimodifikasi sesuai dengan alat yang dipakai
yaitu terdiri dari dua tahap . Tahap pertama
biakan bakteri segar berumur 24 jam yang
tumbuh pada media AD diambil lalu
dilarutkan dalam media preservan . Sebanyak
200 il larutan bakteri dimasukkan kedalam
ampul kaca steril yang berdiameter 5 mm
dan panjang 10 cm dan tebal 0,5 mm .
Ampul yang berisi bakteri disumbat dengan
kapas steril, kapas yang masuk kedalarn
ampul panjangnya 1cm . Kapas yang berada
diluar ampul dipotong rata dengan
permukaan lubang ampul menggunakan
gunting steril, dengan menggunakan batang
besi steril, kapas didorong kedalam ampul
hingga kapas berada pada posisi 4 cm diatas
dasar ampul . Letakkan ampul didalam
lubang piringan alat sentrifus, selanjutnya
piringan yang telah diisi ampul dipasangkan
pada alat sentrifus yang berada diatas mesin
pembeku pada mesin pengering beku lalu
ditutup . Kemudian
hidupkan
mesin
pembeku, tunggu hingga suhu dalam ruang
mesin pembeku mencapai suhu -40 °C .
Setelah suhu tercapai hidupkan mesin
sentrifus selanjutnya buka katup gas ballast
yang berada pada pompa penghisap lalu
hidupkan pompa hisap . Bakteri dalam ampul
sudah membeku lalu mesin sentrifus
dimatikan . Biarkan mesin hidup hingga
bakteri dalam ampul mengering, proses
sublimasi ini berjalan selama semalam .
Setelah bakteri kering, matikan semua mesin
selanjutnya ampul dikeluarkan dari mesin
pengering beku .
Tahap kedua lalu
diker_jakan yaitu membuat bentuk lekukan
pada ampul dengan alat Ampoule constrictor
(Edwards, Inggris) agar memudahkan dalam
pemotongan dengan alat penyembur api .
Sebelum ampul dibentuk hidupkan mesin
pengering beku, setelah suhu mencapai -40
°C, ampul yang sudah dibentuk Iekukkan
dipasang pada lubang karet yang berada
diatas mesin pengering beku kemudian tutup
katup gas ballast pada pompa penghisap .
27 1
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Peulanian 2006
selanjutnya pompa dihidupkan biarkan
mesin hidup selama 2 jam . Dalam keadaan
mesin hidup kondisi dalam ampul hampa
udara, dalam kondisi ini ampul dipotong
tepat pada lekukannya dengan
cara
membakar ampul dengan alat pengelas
ampul (Edwards Flame master hand torch
flame, Inggris) . Ampul berisi biakan bakteri
kemudian kehampaannya diuji dengan alat
vacuum tester (Edwards ST200K MKII,
Inggris) kemudian bakteri kering dalam
ampul sebanyak 10% dari jumlah produksi
dibuka kemudian diuji kemurnian, bakteri
murni selanjutnya diberi label kemudian
dikoleksi di laboratorium BCC dan jika
bakteri tercemar maka bakteri hasil kering
beku dimusnahkan .
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari data pada tabel I diperoleh hasil
bahwa bakteri yang diawetkan dengan
metode kering beku mampu bertahan dalam
penyimpanan selama 16 hingga 22 tahun,
tanpa mengalami perubahan daya hidup
demikian juga kemurnian bakteri dapat
dipertahankan . Bakteri yang diuji sebanyak
9 biakan, yaitu terdiri I biakan mati dan 8
biakan masih hidup dan murni, hasil dapat
dilihat pada tabel 1 .
Tabel 1 . Hasil uji daya hidup dan kemurnian hakteri yang diawetkan dengan metode kering beku
dan disimpan dalam jangka lama .
No
I
2
3
4
5
6
7
8
9
Kode Biakan
_
BCC B2205
BCC B0717
BCC 131979
BCC B0001
BCC B2205
BCC B 1993
BCC B 1624
BCC B0003
BCC B0005
Nama Biakan
Pasteurella multocida
Staphylococcus epidermidis
Acinetobacter calcolacepticus
Pasteurella multocida
Pasteurella multocida
Pseudomonas aeroginosa
Aeromonas hidrophvlla
Pasteuurella anrltocida
Pasteurella multocida
TANGGAL
kering beku buka ampul
25 .10 .88
17 .01 .06
25 .10 .88
17 .01 .06
10 .84
12 .01 .06
25 .10 .88
17 .01 .06
02 .02 .90
20 .02 .06
10 .84
1 1 .04 .05
22 .01 .86
11 .05 .05
20 .05 .85
01 .06 .06
20 .05 .85
01 .06 .06
Masa
Simpan
18 thn
18 thn
22 thn
18 thn
16 thn
22 thn
20 thn
21 thn
21 thn
Hasil
Uji
hm *
hm
hm
mati
hrn
hm
hm
hm
hm
Keterangan : hm = hidup dan murni
Bakteri yang diawetkan dengan
metode pengering bekuan selama dalam
penyimpanan tidak memerlukan perlakuan
khusus seperti pada metode lain misalnya
pada metode subkultur secara periodik
bakteri dipindah biakkan ke media baru,
karena media tahan selama heherapa minggu
sampai satu bulan (COWAN 1974) . Bakteri
kering beku akan terjaga dari pencemaran
selama penyimpanan,
sedangkan pada
metode subkultur bakteri rentan terhadap
pencemaran .
Walaupun metode kering beku
merupakan metode yang efektif tetapi masih
ditemukan kematian pada bakteri, kejadian
tersebut disebabkan oleh kebocoran ampul
yang retak pada bagian yang di bakar atau
272
dipotong sehingga kadar air naik . Kadar air
yang baik untuk menekan metabolisme
adalah 1-2% (LAPAGE et al., 1970) dan dari
bahan ampul yang tidak haik kandungan
gelasnya sehingga pada waktu ampul
dibentuk lekukan dengan cara dibakar
memerlukan waktu yang lama, sebaiknya
ampul dibuat dari bahan neutral glass
(ROWE. 1978) dan dari sisa deterjen waktu
ampul dicuci .
Hasil uji kemurnian dan daya hidup
bakteri pasca proses kering beku yang
dikoleksi di unit produksi BCC diterangkan
dalam Tabel 2 . Proses pengawetan dengan
metode kering beku tidak merubah daya
hidup dan kemurnian biakan bakteri yang
diuji .
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Tabel 2 . Hasil uji kemurnian dan daya hidup bakteri pasca proses kering beku sebelurn dikoleksi .
No
I
2
3
Kode
.
I3iakan
BCC
B 1624
BCC
B1979
BCC
B0717
205
4
B2
5
B1993
BCC
B0003
BCC
B 0005
6
7
Nama Biakan
TANGGAL
buka
kering beku
ampul
Hasil
Uji
Tindakan
Aeromonashidrophylla
12 .01 .06
16.01 .06
murni
koleksi
Acinetobacter
calcolacepticus
24 .01 .06
26.01 .06
murni
koleksi
Staphylococcus
epidermidis
08 .02 .06
13 .02 .06
murni
koleksi
Pasteurella multocida
07 .03 .06
09 .03 .06
murni
koleksi
Pseudomonas aeroginosa
17 .05 .06
22 .05 .06
murni
koleksi
Pasteurella multocida
06 .06 .06
12 .06 .06
murni
koleksi
Pasteurella multocida
06 .06 .06
12 .06 .06
murni
koleksi
KESIMPULAN DAN SARAN
Dapat diambil kesimpulan bahwa
pengawetan biakan bakteri dengan metode
kering beku sangat haik karena terhukti
dapat menahan daya hidup dan kemurnian,
dan efisien karena tidak memerlukan
perawatan khusus. Biakan yang diawetkan
dengan metode kering beku dapat bertahan
dalam jangka lama . Kemasan ampul bakteri
kering beku terbuat dari bahan kaca maka
perlu dijaga agar tidak retak pada waktu
penyimpanan dengan cara membungkusnya
dengan kapas atau dimasukkan kedalam
wadah yang anti pecah . Walaupun biakan
yang dimiliki merupakan biakan yang selalu
digunakan di laboratorium, sebaiknya biakan
tersebut dijaga kelestariannya dengan
.pengawetan kering beku .
UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis menyampaikan terimakasih
kepada Drh . Siti Chotiah yang telah
kan
ijin, dukungan
dan
memberi
bimbingannya dan kepada sdr . Sukatma
terimakasih atas kerjasamanya .
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
DAFTAR BACAAN
Anonimous . 1983 . Edward High Vacuum .
Edward EF4 Modulyo Freeze Dry
Instruction . Manor Royal, Crawley,
Sussex, England .
Anonimous, 2001 . Kit Identification system for
non-pastidious, non enteric Gram'sapi ® 20NE,
negative
rods .
BIOMERIEUX, France .
Cowan, S .T . 1974 . Cowan and Steel's . Manual of
Identification of Medical Bacteriology
2nd ed . Cambridge University Press,
Cambridge .
Rowe TWG and JW Snowman . 1978 . Edwards
Freeze-Drying Handbook Edwards High
Vacuum, Crawley, Sussex, England .
Lapage, S .P ., J .E . Shelton, T .G . Mitchell, and
Method in
A .R . Marckenzic, 1970 .
Microbiology . Acad Press, London .
Sugiawan,W . 2000 . Teknik Pengawetan Bakteri,
Khamir dan Kapang dengan Metode
(Freeze Dry).
Pengering
Bekuan
Prosiding Temu Teknis Fungsional Non
Peneliti . Pusat Penelitian Peternakan,
Badan Penelitian dan Pengembangan
Pertanian, Departemen Pertanian . Bogor,
5 September 2000 . HIm :29-39 .
273