1. SAMPUL_THESIS

15
BAB III
BAHAN DAN CARA KERJA
A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Laboratorium Institute of Human Virology and
Cancer Biology of the University of Indonesia (IHVCB-UI) Gedung IASTH
Lantai 8, Jalan Salemba Raya No. 4, Jakarta Pusat, selama 6 bulan
(November 2007--April 2008).
B. BAHAN
Bahan yang digunakan adalah 10x PCR Buffer [Qiagen], 10 mM dNTP
mix [Qiagen], HotStar Taq DNA Polymerase [Qiagen], Distilled water
[Qiagen], 5x Q-Solution [Qiagen], 25 mM MgCl2, primer (H896F, H869F,
H843F, H819F, H791F, H765F, H729F, H703F (forward) dan H923R, H953R,
H979R, H1003R, H1028R, H1051R, H1078R, H1104R (reverse)) [Qiagen],
tabung sentrifus 1,5 ml [Axygen], tabung PCR 0,2 µl [Axygen], millipore
water, 30 % acrylamid mix [BioRad], 10 % Ammonium persulfate (APS)
[BioRad], TEMED [Promega], 10x TBE buffer [BioRad] , 6x loading dye
solution [Fermentas] , O’Range ruler 100 bp DNA ladder [Fermentas], etidium
bromida (EtBr) [Promega], dan tips (2 µl, 10 µl, 20 µl, 100 µl dan 1000 µl).
15
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
16
C. PERALATAN
Peralatan yang digunakan adalah pipet mikro (0,1--2 µl; 10 µl; 2--20 µl;
100 µl; 20--200 µl; dan 1000 µl) [Gilson dan Bio Rad], [Axygen], vorteks
[Heidolph], sentrifus [Bio Rad], mesin PCR thermal cycler [PTC-200 DNA
engine cycler], freezer -20° C [Goldstar dan Daichi ], running machine [Bio
Rad], dan mini protean 3 cell sets [Bio Rad].
D. CARA KERJA
Sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 dilakukan menggunakan metode PCR dengan variasi
penambahan primer (Gambar 4). Produk PCR yang dihasilkan
divisualisasikan dengan elektroforesis pada gel poliakrilamid 12 %. Skema
kerja penelitian secara umum dapat dilihat pada Gambar 5.
1. Sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 dengan teknik PCR.
Sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 dilakukan dengan amplifikasi primer-primer yang memiliki
daerah overlap pada ujung 3’. Amplifikasi dilakukan berdasarkan metode
Qiagen (2005: 13) dengan modifikasi variasi penambahan primer. Campuran
reaksi amplifikasi terdiri dari 10x HotStar PCR buffer, 5x Q Solution, 10 mM
dNTP mix, HotStarTaq polymerase, primer, dan distilled water. Volume
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
17
campuran reaksi PCR pada masing-masing metode penambahan primer
dapat diliha pada Lampiran 3--7.
Amplifikasi diawali dengan pembuatan campuran reaksi (reaction
mixture) PCR. Thawing, vorteks, dan sentrifugasi dilakukan terlebih dahulu
pada masing-masing reagen PCR, sebelum pembuatan campuran reaksi
PCR. Thawing dilakukan untuk mencairkan masing-masing komponen yang
sebelumnya dalam keadaan membeku. Vorteks dilakukan untuk
homogenisasi larutan. Sentrifugasi dilakukan untuk menarik larutan yang
menempel pada dinding dan tutup tabung agar turun ke dasar tabung.
Campuran reaksi PCR selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung PCR
dengan volume 10 µl. Jumlah tabung PCR yang digunakan sesuai dengan
jumlah pasangan primer yang digunakan pada setiap metode penambahan
primer dalam setiap reaksi PCR yang dilakukan. Metode penambahan
primer yang dilakukan dalam penelitian adalah sebagai berikut:
(1) Metode ke-1 (Delapan pasang primer ditambahkan secara bersamaan
pada awal siklus untuk satu kali reaksi PCR).
(2) Metode ke-2 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam satu kali reaksi
PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi
PCR).
(3) Metode ke-3 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam dua kali reaksi
PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi
PCR).
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
18
(4) Metode ke-4 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam empat kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu
reaksi PCR).
(5) Metode ke-5 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam delapan kali
reaksi PCR).
Pasangan primer tersebut ditambahkan ke dalam reaksi PCR dengan
cara mengkondisikan mesin PCR dalam keadaan pause. Pasangan primer
yang akan ditambahkan ke dalam reaksi PCR, sebelumnya telah dicampur
dengan campuran reaksi (reaction mixture) PCR. Pasangan primer H896F
dan H923R dimasukkan pada awal siklus reaksi PCR pertama untuk setiap
metode penambahan primer. Pada metode ke-1, delapan pasangan primer
dimasukkan pada awal siklus dalam 1 reaksi PCR (Gambar 6). Sementara
itu, pada metode ke-2 sampai metode ke-4, pasangan primer berikutnya
dimasukkan selang 3 siklus dalam 1 reaksi PCR (Gambar 7--9). Pada
metode ke-5, 1 pasang primer dimasukkan pada awal siklus dalam 1 reaksi
PCR (Gambar 10). Mesin PCR dikondisikan dalam keadaan running kembali
setelah pasangan primer ditambahkan ke dalam tabung PCR. Fragmenfragmen DNA sintetik yang dihasilkan pada reaksi PCR pertama, selanjutnya
digunakan sebagai cetakan (template) untuk primer-primer lainnya pada
reaksi PCR kedua. Proses tersebut diulang hingga kedelapan pasangan
primer digunakan dalam masing-masing metode penambahan primer.
Kondisi reaksi PCR adalah denaturasi awal 95° C se lama 15 menit.
Selanjutnya dilakukan denaturasi pada 94° C selama 30 detik, annealing
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
19
pada 55° C selama 30 detik, dan polimerisasi pada 7 2° C selama 30 detik,
sebanyak 35 siklus. Selanjutnya dilakukan polimerisasi akhir pada 72° C
selama 10 menit. Produk PCR kemudian dianalisis dengan gel poliakrilamid
12% dengan penanda 100 pb.
2. Visualisasi produk PCR dengan elektroforesis
Elektroforesis dilakukan berdasarkan Sambrook & Russell
(2001: 6.6--6.8). Produk PCR dianalisis menggunakan gel poliakrilamid
dengan konsentrasi 12%. Gel poliakrilamid terdiri dari campuran millipore
water, 10x TBE buffer, 30 % polyacrilamyde gel, TEMED, dan 10 % APS
(Lampiran 8).
Sebanyak 4 µl produk PCR dicampur dengan 2 µl dapar 6x loading
dye solution di atas parafilm. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke
dalam sumur pada gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid tersebut sebelumnya
telah dihomogenkan atau direndam dalam 1x TBE buffer di dalam
electrophoresis chamber. Sebanyak 3 µl penanda DNA 100 pb dimasukkan
ke dalam sumur yang berdekatan dengan sampel produk PCR.
Aparatus elektroforesis dihubungkan dengan tegangan listrik tetap
120 V dan arus listrik 400 mA selama 60 menit. Gel poliakrilamid selanjutnya
direndam dalam larutan etidium bromida (EtBr) dengan konsentrasi 1 µg/ml
selama 2--3 menit. Selanjutnya gel poliakrilamid dicuci dengan 1x TBE
buffer. Hasil elektroforesis selanjutnya divisualisasikan dengan sinar UV
kemudian didokumentasikan dengan Geldoc.
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008