30 BAB III METODE PENELITIAN A. Rancangan Penelitian

30
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian ini adalah observasional analitik. Observasi dilakukan
dengan pendekatan cross sectional dimana hanya diamati satu kali dan pengukuran
subjek dilakukan pada saat pemeriksaan tersebut. Peneliti ingin mengetahui
perbedaan rasio ekspresi RANKL/OPG sebagai variabel bebas dan destruksi tulang
sebagai variabel terikat.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
1. Tempat penelitian
a. Poliklinik THT RSUD Dr Moewardi Surakarta untuk mendapatkan sampel
penelitian.
c. Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret
dan RSUD Dr Moewardi Surakarta.
d. Bagian Radiologi RSUD Dr. Moewardi Surakarta
2. Waktu penelitian
Pengambilan sampel dimulai bulan Desember 2015 sampai bulan Maret
2016.
31
C. Populasi
Populasi penelitian adalah semua pasien OMSK yang datang berobat ke
poliklinik THT RSUD Dr. Moewardi, Surakarta berdasarkan hasil anamnesis,
pemeriksaan fisik dan pemeriksaan penunjang. Selanjutnya pasien dilakukan
operasi mastoidektomi.
D. Sampel Penelitian
Subjek penelitian adalah semua pasien OMSK yang datang berobat ke
poliklinik THT RSUD dr. Moewardi, Surakarta yang memenuhi kriteria penelitian
dan selanjutnya dilakukan operasi untuk pengambilan jaringan granulasi.
Kriteria inklusi :
1. Laki-laki atau perempuan
2. Pasien yang sudah didiagnosis OMSK tipe benigna dan maligna menjalani
tindakan operasi mastoidektomi untuk pengambilan jaringan mukosa kavum
timpani
Kriteria eksklusi :
1. Pasien OMSK dengan penyakit keganasan kepala leher
2. Pasien OMSK dengan penyakit diabetes melitus tergantung insulin
3. Pasien OMSK dengan penyakit autoimun.
32
E. Besar Sampel
Penentuan besar sampel berdasarkan uji hipotesis dengan menggunakan
koefisien korelasi (r) (Sopiyudin, 2010):
n =
(Zα+ Zβ )
2
+3
0,5 In [(1+r)/(1-r)]
Keterangan :
α
: Kesalahan tipe I. Tingkat kemaknaan 95%, maka berarti α = 0,05
sehingga
Zα = 1,960
β
: Kesalahan tipe II
Power = 1 - β = 1 – 20% = 80%, maka berarti β = 0,20 sehingga Zβ
= 0,842
r
: Koefisien korelasi = 0,61 (Kuczkowsky et al., 2010)
ln
: Logistik natural
n =
(1,96+ 0,842 )
2
+3
0,5 In [(1+0,61)/(1-0,61)]
n = 16 + 3 = 19
Dari perhitungan diatas, sampel yang diperlukan sebanyak 19 orang ditambah
antisipasi perkiraan drop out 10% maka jumlah sampel adalah 22 orang pasien
OMSK.
33
F. Teknik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan dengan tehnik consecutive sampling (non
probability sampling) yaitu semua subjek yang datang dan memenuhi kriteria
pemilihan dimasukkan dalam penelitian sampai besar sampel yang diperlukan
terpenuhi.
G. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas (variabel independent) :
Ekspresi RANKL dan OPG
2. Variabel terikat (variabel dependent) :
Destruksi tulang pada OMSK
H. Definisi Operasional
1. Ekspresi RANKL dan OPG
a. Definisi
:
Ekspresi RANKL adalah ekspresi protein pada permukaan membran sel mukosa
telinga tengah yang irreversibel.
Ekspresi OPG adalah ekspresi protein pada permukaan membran sel mukosa
telinga tengah yang irreversibel.
Rasio ekspresi RANKL/OPG adalah perbandingan ekpresi RANKL dan OPG.
b. Alat ukur
: Imunohistokimia
c. Cara ukur : Imunoreaktivitas antibodi RANKL antihuman dan OPG antihuman
d. Skala ukur : numerik
34
e. Hasil ukur
: nilai positif warna kecoklatan
Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam Intensity Distribution Score (IDS).
Berdasarkan penilaian intensitas warna, hasil pengecatan imunohistokimia
digolongkan menjadi 3 yaitu intensitas kuat nilainya 3 berwarna coklat tua,
intensitas sedang nilainya 2 berwarna coklat muda, intensitas lemah nilainya 1
berwarna kuning keemasan, dan negatif nilainya 0 berwarna biru-ungu. Penilaian
prosentase dilaksanakan secara manual dengan mikroskop cahaya oleh seorang ahli
Patologi Anatomi. Untuk nilai IDS yang diperoleh dari perhitungan sel, masingmasing slide dinilai dari sembilan lapang pandang dan diambil nilai reratanya.
Setelah itu dilakukan penghitungan penentuan skor IDS dengan menggunakan
rumus :
IDS = (3 x %IK) + (2 x %IS) + (1 x %IL) + (0 x % IN)
(Barresi et al., 2011)
Keterangan :
IDS : Intensity Distribution Score
IK : Intensitas positif kuat dengan warna coklat tua
IS
: Intensitas positif sedang dengan warna coklat muda
IL : Intensitas positif lemah dengan warna kuning keemasan
IN : Intensitas negatif dengan warna biru
2. Destruksi tulang pada OMSK
a. Definisi : destruksi tulang yang diakibatkan oleh infeksi pada OMSK
b. Alat ukur : CT Scan mastoid dan atau temuan pada saat operasi
35
c. Cara ukur : Tingkat destruksi tulang ditentukan oleh dokter spesialis THT-KL
sebagai operator mastoidektomi. Tingkat destruksi tulang ditentukan sebagai
berikut :
Tingkat 0 : tidak ada destruksi tulang
Tingkat 1 : destruksi pada skutum dan osikel
Tingkat 2 : destruksi pada tegmen dan seluruh osikel
Tingkat 3 : destruksi pada tegmen, seluruh osikel, kanalis fasialis, dinding liang
telinga, sinus sigmoid, koklea, dan dinding tulang mastoid.
d. Hasil ukur : Ordinal.
I. Alat dan Bahan Penelitian
Alat penelitian yang dipakai pada penelitian ini yaitu :
1. Alat pemeriksaan THT yaitu : lampu kepala, otoskop, aplikator.
2. Set instrumen tindakan operasi mastoidektomi (ME) dengan mikroskop operasi
PBS formalin dan botol untuk menyimpan jaringan biopsi.
3. Bahan jaringan diambil dari mukosa kavum timpani dan antrum mastoid hasil
operasi mastoidektomi.
4. Bahan untuk pewarnaan jaringan dengan teknik imunohistokimia antara lain
antibobi sekunder IgG anti mouse yang dirangkai dengan HRP, antibodi mouse
monoclonal antibody anti human RANKL dan OPG
5. Alat untuk pengecatan imunohistokimia : mikrotom, poly L-Lysine glass slide
(SIGMA), termometer, mounting media (Canada Balsem), microwave oven,
36
inkubator, pipet mikro, deck glass, stop watch, humidified chamber dan ruangan
dalam kondisi kelembaban tinggi.
6. Mikroskop OLYMPUS seri BX 41 untuk pemeriksaan IHC.
J. Cara Kerja
Pasien OMSK yang memenuhi kriteria inklusi dilakukan MSCT-scan
kemudian dilakukan operasi mastoidektomi dengan bantuan mikroskop operasi.
Pada pasien OMSK tipe maligna,
jaringan kolesteatoma diambil di lapisan
perimatrik. Jaringan yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam botol yang
berisi PBS formalin. Spesimen jaringan dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi
RSUD Dr. Moewardi Surakarta untuk dilakukan blok parafin.
Selanjutnya blok parafin dipotong dengan mikrotom setebal 4 mikron. Hasil
potongan jaringan diletakkan pada slide dan digunakan untuk pemeriksaan ekspresi
RANKL dan OPG. Hasil potongan jaringan dilakukan pengecatan imunohistokimia
sebagai berikut :
1. Hasil potongan jaringan diletakkan pada slide poly-L-lysine dan selanjutnya
dinkubasi pada suhu 37oC selama 1 malam (agar lebih merekat pada slide).
2. Deparafinisasi :
-
Direndam dalam xylol I selama 5 menit
-
Direndam dalam xylol II selama 5 menit
-
Direndam dalam xylol III selama 5 menit
-
Direndam dalam xylol IV selama 5 menit
-
Direndam dalam alkohol absolut selama 5 menit
37
-
Direndam dalam alkohol 95% selama 5 menit
-
Direndam dalam alkohol 70% selama 5 menit
-
Dicuci dengan aquadest selama 5 menit
3. Retrival antigen dilakukan pada microwave oven dengan buffer sitrat pH 6,4
pada suhu sedang selama 2 menit dan kemudian dilanjutkan pada suhu
rendah selama 1 menit.
4. Dicuci dengan PBS selama 2 X 5 menit.
5. Tahapan quencing endogenous peroxidase yaitu dengan memasukkan slideslide tersebut ke dalam metanol H2O2 0,3% selama 30 menit.
6. Dicuci kembali dengan aquades/PBS 2 X 5 menit.
7. Langkah-langkah selanjutnya ini dilakukan dalam humidified chamber :
a. Diberikan blocking reagent dan dibiarkan selama 30 menit. Kemudian
dicuci dengan aquadest / PBS 2 x 5 menit.
b. Ditambahkan antibodi primer yang telah dilarutkan dalam antibodi
diluents ( 1:50 ), dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang atau
dalam kulkas pada suhu 4 o C selama 18 jam. Kemudian dicuci dengan
aquadest / PBS selama 2 x 5 menit.
c. Ditambahkan antibodi sekunder berlabel biotin dan diinkubasi selama
30 menit pada suhu 30 o C, lalu dicuci dengan aquadest atau PBS 2 x 5
menit.
d. Ditambahkan substrat DAB (diamino benzidine), ditunggu selama 5
menit, lalu cuci dengan aquadest / PBS 2 x 5 menit.
38
e. Dilakukan perwarnaan counterstaining dengan hematoxcylin Mayer
selama 30 detik dan kemudian dicuci dengan air mengalir selama 2 – 5
menit
f. Selanjutnya ditempelkan pada obyek glass dengan perekat Canada
Balsem.
8. Masing-masing sampel diamati dengan mikroskop cahaya dan dievaluasi
pada sembilan lapang pandang dengan sebaran yang merata, kemudian
dibuat reratanya.
K. Etika Penelitian
Surat persetujuan penelitian diperoleh dari Komisi Etik Penelitian Kedokteran,
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta/RSDM Surakarta.
L. Analisis data
Semua data dianalisis dengan program SPSS 21 for windows. Data selanjutnya
diuji secara statistik dengan menggunakan uji korelasi Spearman. Data deskripsi
karakteristik subjek yang mendukung berupa nominal diuji menggunakan uji chi
square, sedangkan data ordinal
menggunakan uji Mann-Whitney. Derajat
hubungan antara kedua variabel dikatagorikan sangat kuat jika korelasi 0,8001,000, kuat jika korelasi 0,600-0,799 , sedang jika korelasi 0,400-0,599, lemah jika
korelasi 0,200-0,399, sangat lemah jika korelasi 0,000-0,199.
39
M. Alur Penelitian
Populasi Penelitian
Kriteria
Kriteria
Inksklusi
Eksklusi
`
Tingkat 0
OMSK tipe benigna dan
maligna
Hasil CT Scan dan atau
temuan operasi
Tingkat 2
Tingkat 1
Tingkat 3
IL-17
IL-17
Ekspresi
RANKL dan OPG
IL-17
Ekspresi
RANKL dan OPG
Ekspresi
RANKL dan OPG
IL-17
Ekspresi
RANKL dan OPG
IL-17
Rasio
RANKL/OPG
IL-17
Rasio
RANKL/OPG
IL-17
Rasio
RANKL/OPG
IL-17
Rasio
RANKL/OPG
IL-17
IL-17
IL-17
IL-17
Analisis