Document

DETEKSI KOI HERPESVIRUS (KHV)
DENGAN METODE PCR
1. Tujuan
Untuk mendeteksi KHV (koi herpesvirus ) secara benar
2. Ruang Lingkup
Melakukan deteksi KHV (koi herpesvirus) dengan metode PCR
3. Acuan
OIE, 2009. Manual of Diagnostics Test for Aquatic Animals. Chapter 2.3.6, hal. 236-250
4. Bahan
a. Lysis solution (100 mM NaCl; 10 mM Tris/HCl pH 8; 25 mM EDTA; 0,5% SLS atau
2% SDS; dan 0,5 mg/ml Proteinase K)
b. 5 M NaCl
c. Larutan 10% CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) dalam 0,7 M NaCl
d. Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)
e. Larutan phenol yang telah diekuilibrasi
f. Ethanol 95%
g. Ethanol 70%
h. double distilled water (DDW)
i. Go Taq PCR Core System I (Promega): 5XPCR Buffer, 25 mM MgCl 2, 10 mM
dNTPMix (200 µM setiap dNTP), dan Go Taq DNA polymerase (5U/µl)
j. 1 set primer (10 µM) :
- 290 F
: 5’- GAC ACC ACA TCT GCA AGG AG - 3’
- 290 R
: 5’- GAC ACA TGT TAC AAT GGT GGC – 3’
k. Larutan 1 M Tris-HCl pH 7,4
l. 0,5 M EDTA pH 8
m. Agarose
n. Ethidium bromide (10 mg/ml)
o. Loading buffer
p. Larutan TBE
q. 100 bp DNA ladder
r. Akuades
5. Alat
a. Fume hood
h. Thermal cycler
b. Sentrifus
i. Elektroforesis horizontal
c. Vortex mixer
j. UV transiluminator
d. Waterbath
k. Kamera digital
e. Mikropipet
f. Laminar flow horizontal (biohazard)
g. UV spektrofotometer
6. Prosedur kerja
a. Pembuatan 10 % Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)
1) Larutkan 100 gr SDS elektroforesis grade ke dalam 900 ml akuades
2) Panaskan pada suhu 68oC untuk melarutkan SDS
3) Atur pH 7,2 dengan menambahkan beberapa tetes HCl pekat
4) Tambahkan akuades hingga 1 L dan masukkan ke dalam botol reagen
5) Sterilkan dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121oC
6) Untuk membuat 1% SDS, tambahkan 1 bagian 10 % larutan SDS dengan 9 bagian
akuades
b. Lysis solution
1) Masukkan 77 ml akuades steril ke dalam tabung berkapasitas 100 ml
2) Masukkan 2 ml NaCl (5 M), 1 ml Tris HCl (1 M pH 8,0), 5 ml EDTA (0,5 M, pH
8,0), dan 10 ml SDS (20%, pH 7,2)
3) Tambahkan Proteinase K (10 mg/ml) sebanyak 5 ml sesaat sebelum digunakan
c. Pembuatan 5 M NaCl
1) Larutkan 292 gr NaCl dalam 800 ml akuades
2) Tambahkan akuades sampai 1 L
3) Bagi dalam beberapa botol
4) Sterilkan dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121oC
d. Pembuatan 10% CTAB dalam 0,7 M NaCl
1) Larutkan 4,1 gr NaCl dalam 80 ml akuades dan secara perlahan tambahkan 10 gr
CTAB sambil dipanaskan pada suhu 55oC dan diaduk dengan magnetic stirrer.
2) Tambahkan akuades hingga volumenya menjadi 100 ml. Simpan pada suhu di
atas 15oC untuk mencegah CTAB terpresipitasi.
e. Pembuatan 1 M Tris-HCl pH 7,4 dan pH 8,0
1) Larutkan 121,1 gr Tris base dalam 800 ml akuades
2) Atur pH dengan menambahkan 70 ml HCl pekat (untuk pH 7,4) atau 42 ml (untuk
pH 8,0)
3) Biarkan larutan dingin pada suhu kamar sebelum pengaturan pH terakhir
4) Tambahkan akuades hingga 1 L
5) Bagi dalam beberapa botol
6) Sterilkan dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121oC
f. Ekuilibrasi phenol
1) Sebelum digunakan, phenol diekuilibrasi sehingga pHnya kurang dari 7,8 karena
pemisahan DNA pada fase organik terjadi pada pH asam. Gunakan sarung tangan,
masker, dan jas laboratorium saat melakukan ekuilibrasi phenol.
2) Simpan phenol cair pada suhu -20oC. Saat digunakan, keluarkan phenol dari
freezer, biarkan pada suhu ruang, dan cairkan pada suhu 68oC. Tambahkan
hydroxyquinoline hingga konsentrasi akhirnya 0,1%. Bahan ini merupakan suatu
anti oksidan, inhibitor parsial RNase, dan pengikat lemah ion logam. Warna
kuning bahan ini memudahkan untuk membedakan fase organik.
3) Ke dalam phenol yang telah mencair, tambahkan dengan volume yang sama
buffer 0,5 M Tris-HCl pH 8,0 pada suhu ruang. Campur dengan menggunakan
magnetic stirrer selam 15 menit. Matikan stirrer, setelah kedua fase terpisah, hisap
sebanyak mungkin fase atas (fase air) menggunakan pipet gelas yang
dihubungkan dengan vacuum line yang dilengkapi vacuum traps.
4) Tambahkan dengan volume sama 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 ke dalam phenol. Aduk
dengan magnetic stirrer selama 15 menit. Matikan stirrer dan buang fase air
bagian atas seperti pada tahap 3). Ulangi ekstraksi hingga pH fase phenol kurang
dari 7,8 (diukur dengan kertas pH).
5) Setelah phenol diekuilibrasi dan fase air terakhir telah dibuang, tambahkan 0,1 x
volume 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 yang mengandung 0,2% β-mercaptoethanol.
Larutan phenol disimpan dalam botol gelap pada suhu 4oC untuk periode hingga 1
bulan.
g. Pembuatan 0,5 M EDTA pH 8
1) Tambahkan 186,1 gr disodium ethylene diamine tetra acetate-2H2O dalam 800 ml
akuades
2) Aduk dengan magnetic stirrer
3) Atur sampai pH 8 dengan menambahkan NaOH (-20 gr NaOH pellet)
4) Sterilkan dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121oC
h. Pembuatan buffer TBE (Tris Boric EDTA)
1) Untuk membuat larutan stok 5X, masukkan 800 ml akuades ke dalam beaker
berkapasitas 1 L
2) Timbang 54 gr Tris base dan 27,5 gr Boric acid
3) Masukkan keduanya ke dalam beaker yang telah berisi akuades dan aduk dengan
magnetic stirrer sampai terlarut
4) Masukkan 20 ml 0,5 M EDTA, aduk sampai tercampur rata
5) Tambahkan akuades sampai 1 L
6) Masukkan dalam botol reagen dan sterilkan dengan autoclave selama 15 menit
pada suhu 121oC
7) Untuk membuat larutan siap pakai yang mengandung 0,045 M Tris boric dan
0,001 M EDTA, larutkan 1 bagian larutan stok dengan 9 bagian akuades.
i. Pembuatan Ethidium Bromide (10 mg/ml)
1) Tambahkan 1 gr ethidium bromide ke dalam 100 ml akuades
2) Aduk dengan magnetic stirrer beberapa jam sampai ethidium bromide terlarut
3) Bungkus tabung dengan alluminium foil atau pindahkan ke dalam botol gelap dan
simpan pada suhu kamar.
j. Pembuatan 2% gel agarose
1) Agarose ditimbang sebanyak 2 gr dan ditambah dengan 0,5x larutan TBE
2) Goyang-goyang larutan dan biarkan kira-kira selama 1 menit
3) Panaskan dengan microwave oven sampai larutan menjadi bening
4) Larutan dibiarkan hingga suhu kira-kira 60oC, kemudian dituang ke dalam
cetakan gel yang telah disiapkan. Untuk cetakan yang berisi kecil (8 sampel)
dituangkan sebanyak 15 ml dan untuk cetakan besar (17 sampel) sebanyak 30 ml
5) Dibiarkan dingin selama 0,5 jam dan gel siap digunakan.
k. Ekstraksi DNA
1) Masukkan 100-200 mg jaringan insang ke dalam mikrotube 1,5 ml d 600 µl lysis
solution (100 mM NaCl; 10 mM Tris/HCl pH 8; 25 mM EDTA; 0,5% SLS atau
2% SDS; dan 0,5 mg/ml Proteinase K yang ditambahkan sesaat sebelum
digunakan).
2) Homogenisasi jaringan dalam mikrotube dengan baik menggunakan disposable
stick.
3) Inkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam.
4) Tambahkan 5 M NaCl sehingga konsentrasi akhir 0,7 M. Tambahkan secara
perlahan 1/10 volume 10% CTAB dalam 0,7 M NaCl, dan campur dengan baik.
5) Inkubasi pada suhu 65oC selama 10 menit, kemudian pada suhu kamar tambahkan
chloroform/isoamyl alcohol isovolume dan campur dengan baik. Sentrifus pada
kecepatan 13.000 g selama 5 menit dan kemudian pindahkan fase air (lapiran
atas) ke dalam mikrotube 1,5 ml baru dan tambahkan phenol isovolume.
6) Campur dengan baik dan sentrifus dengan kecepatan 13.000 g selama 5 menit.
Pindahkan larutan lapisan atas dan lakukan ekstraksi phenol sekali atau dua kali
lagi.
7) Pindahkan larutan lapisan atas ke dalam mikrotube baru dan tambahkan dua kali
volume chloroform/isoamyl alcohol. Campur dengan baik. Sentrifus derngan
kecepatan 13.000 g selama 5 menit.
8) Pindahkan larutan lapisan atas ke dalam mikrotube baru dan presipitasi DNA
dengan menambahkan dua kali volume ethanol 95% atau absolut. Letakkan pada
suhu -20oC selama 30 menit atau -80oC selama 15 menit.
9) Sentrifus dengan kecepatan 13.000 g selama 30 menit dan buang ethanol. Cuci
pellet dengan ethanol 70%, keringkan dan resuspensi dengan 100 µl DDW steril
pada suhu 65oC selama 15 menit.
10) Gunakan 1 µl larutan DNA untuk setiap reaksi PCR.
l. Reaksi PCR untuk deteksi KHV
1) Komposisi larutan PCR untuk deteksi KHV (25μl/ reaksi) dibuat dengan
mencampurkan bahan-bahan sebagai berikut :
 DDW
15,875 µl
 5XPCR buffer
5
µl
 MgCl2
1,5
µl
 dNTP Mix
0,5
µl
 Primer 292F
0,5
µl
 Primer 292R
0,5
µl
 Taq DNA polymerase
0,125 µl
 Sampel DNA
1
µl
Total volume
25
µl
2) Banyaknya bahan yang dipersiapkan adalah 1,1 x jumlah sampel
3) Setelah semua bahan dicampur, kecuali sampel DNA bagikan ke dalam mikrotube
0,2 ml dengan volume masing-masing 24 l
4) Tambahkan template DNA, termasuk kontrol negatif dan kontrol positif
5) Pengaturan suhu pada thermal cycler sebagai berikut :
Thermal cycler diatur dengan hot start 94°C selama 30 detik, suhu denaturasi
94°C selama 30 detik, suhu annealing 63°C selama 30 detik, suhu extention 72°C
selama 30 detik. Proses PCR dilakukan sebanyak 40 siklus. Kemudian dilanjutkan
dengan extra extention 72°C
selama 7 menit. Setelah proses selesai sampel
disimpan pada suhu 4°C.
m. Pengamatan hasil PCR pada gel agarose
1) Masukkan 2% gel agarose ke dalam elektroforesis
2) Tambahkan larutan TBE ke dalam elektroforesis hingga gel agarose terendam
3) Sampel hasil PCR diambil sebanyak 5µl dan ditambah dengan loading buffer
sebanyak 1µl. Campur dengan baik, kemudian disuntikkan ke dalam lubang
sumuran dengan menggunakan mikropipet.
4) Setelah semua sampel disuntikkan, pasang tutup elektroforesis dan hidupkan
listrik dengan voltage diatur 150 V
5) Setelah 0,5 jam, proses dihentikan dan gel agarose direndam dalam larutan
ethidium bromide (5µg/ml) selama 5 menit
6) Kemudian gel agarose direndam dalam akuadest selama 10 menit untuk
menghentikan proses pewarnaan
7) Gel agarose diamati di atas UV transilluminator :
 Hasil positif terdeteksi KHV bila terlihat perpendaran pita DNA dengan
ukuran 292 bp
 Hasil negatif KHV bila tidak terlihat perpendaran pita DNA dengan ukuran
292 bp