6 PROTEIN REKOMBINAN

6
PROTEIN REKOMBINAN
6.1 PENDAHULUAN
Protein adalah bahan yang paling penting dari semua bahan yang membentuk organisme
hidup. Protein terkandung dalam setiap sel hidup pada semua organisme, tanpa pengecualian,
dan di dalam sel, protein berada dalam jumlah yang sangat banyak dengan berbagai bentuk
atau jenis. Semua karakteristik dari organisme ditentukan oleh aktivitas protein.
6.2 LATAR BELAKANG
Dalam biologi molekuler, yang disebut “Central Dogma”, menyatakan bahwa informasi gen
yang tersimpan di dalam DNA dipindahkan ke RNA dan kemudian dipindahkan ke protein.
Proses transfer dari DNA ke RNA disebut proses transkripsi, sedangkan proses transfer dari
RNA ke protein disebut proses translasi. Kode-kode gen dalam protein disebut gen struktural
karena mereka bertanggung jawab untuk mengekspresikan informasi gen ke dalam unit
struktural pada manusia, seperti warna mata, kulit dan rambut.
6.3 DEFINISI
Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam
berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan
memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Pembentukan protein rekombinan
dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vector. Teknologi rekombinan
adalah proses yang terlibat dalam pembentukan protein rekombinan.
69
6.3.1 Rekombinasi
Rekombinasi adalah suatu proses dimana suatu progeny (keturunan) dikembangkan menjadi
kombinasi gen-gen yang berbeda dari gen-gen kedua orang tua nya, yang menghasilkan satu
set DNA baru.
Gambar 6.1. Penyilangan molekul DNA untuk menghasilkan protein rekombinan
Ditunjukkan pada gambar 6.1 adalah proses dari rekombinasi protein, diadaptasi dari
artikel dari Pusat Informasi Nasional Bioteknologi (NCBI).
Istilah “protein” digunakan karena protein adalah struktur yang mendukung DNA dan
merupakan blok bangunan materi hidup. Digunakan istilah “DNA rekombinan” untuk
menggambarkan urutan DNA baru yang telah dihasilkan dari rekombinasi gen dari kedua
orang tuanya. Proses rekombinan tersebut menjadi landasan terhadap kejadian evolusi dari
makhluk hidup.
6.4 PROTEIN REKOMBINAN
Teknologi DNA rekombinan adalah salah satu cara mempelajari fungsi dan interaksi dari
protein. Hal ini dilakukan dengan mengisolasi urutan DNA target dan kemudian
memindahkannya ke vektor kloning yang memiliki kemampuan untuk mereproduksi diri.
Urutan DNA dari vektor kloning berinteraksi dengan DNA target dan menghasilkan cetak
biru informasi gen baru yang disebut
DNA rekombinan. DNA rekombinan tersebut
ditransfer ke RNA, yang pada proses berikutnya menghasilkan protein rekombinan.
6.4.1 Produksi protein rekombinan
Rekombinan DNA merupakan bidang ilmu pengetahuan yang hangat diperbincangkan yang
berhubungan dengan pembuatan organisme – mulai dari bakteri hingga kambing -memproduksi protein yang biasanya tidak dihasilkan oleh suatu organisme. Penelitian di
bidang ini telah menghasilkan berbagai macam aplikasi dimana pada beberapa tahun yang
lalu masih belum memungkinkan. Penderita diabetes yang biasanya bergantung pada insulin
70
dari babi, dimana mirip dengan manusia tetapi tidak persis sama, sekarang dapat memiliki
insulin dari manusia yang pada saat ini telah dapat diproduksi oleh bakteri. Penderita
hemophilia dapat menggunakan faktor pembekuan yang telah diproduksi dalam susu
kambing. Sementara ilmu pengetahuan yang kompleks, dapat diuraikan ke dalam konsep
yang lebih sederhana.
Gambar 6.2. Skema rekombinasi protein
Dalam rangka untuk memahami bagaimana protein rekombinan dibuat, sebelumnya
kita perlu memahami bagaimana semua protein dibentuk. DNA berada didalam inti sel, DNA
memegang semua petunjuk yang diperlukan untuk membentuk suatu organisme. Seiring
dengan itu rangkaian helai panjang dari DNA adalah suatu instruksi untuk terbentuknya
berbagai protein.
6.4.2 Struktur DNA
DNA adalah dasar genetik untuk semua makhluk hidup dan seluruh kehidupan pada dasarnya
mempunyai struktur DNA yang sama. Untai panjang dari DNA pada dasarnya terdiri dari
jutaan unit berulang yang disebut nukleotida. Setiap nukleotida memiliki tiga bagian: gula,
gugus fosfat dan basa nitrogen. Struktur akhir DNA adalah dua helai yang terhubung di
bagian tengah, mirip sebuah tangga atau tangga spiral. Masing-masing sisi terdiri dari fosfat
dan gula yang berulang-ulang terus dan penghubung diantaranya terdiri dari dua basa
nitrogen yang bergabung bersama-sama. Hanya ada empat basa nitrogen dan mereka
direpresentasikan dengan kode-kode TCAG. Sebuah DNA dari organisme merupakan jutaan
71
basa-basa panjang tetapi urutan dari Ts, Cs, As dan Gs yang membuat kita mempunyai
perbedaan satu dengan yang lainnya.
6.4.3 Struktur dan Fungsi protein
DNA yang kita miliki menentukan dengan tepat bagaimana kita akan terlihat dan bagaimana
setiap sifat yang kita miliki, tetapi semua DNA hanya merupakan kode-kode sederhana untuk
protein-protein yang berbeda. Sebenarnya protein tersebut yang membuat kita menjadi
bentuk seperti sekarang ini. Protein merupakan rangkaian rantai panjang dari asam amino
sama seperti DNA yang juga merupakan rantai panjang dari nukleotida. Terdapat 20 asam
amino pada keberadaan protein dan setiap organisme menggunakan 20 asam amino tersebut
dalam kombinasi yang berbeda-beda untuk membentuk setiap protein .
Urutan asam amino ini sangat penting karena urutan tersebut memberikan bentuk
akhir dari protein. Bentuk dari protein sangat penting, hal tersebut memberikan karakteristik
dari protein. Inilah sebabnya mengapa protein rekombinan sangat penting. Menggunakan
insulin babi, yang memiliki struktur sedikit berbeda dengan insulin manusia, selalu berisiko
karena beberapa orang akan menolaknya. Namun, insulin rekombinan mempunyai urutan
asam amino yang persis sama seperti insulin manusia, kecuali yang dihasilkan oleh bakteri.
Hanya karena bakteri memiliki kode genetik didalamnya tidak berarti bahwa bakteri
akan segera memulai membuat suatu protein rekombinan. Para ilmuwan harus merekayasa
bagian promotor untuk melampirkan kode yang diinginkan sebelumnya dan kemudian
mereka dapat mengaktifkannya. Setelah semua ini ditambahkan ke dalam bakteri atau
organisme lain, sel-sel mulai membuat protein baru, karena urutan dari asam amino yang
sama maka produk protein akan 100% identik dengan sumbernya dank arena itu lebih aman
untuk digunakan.
6.4.4 Pilihan host untuk amplifikasi protein
Sistem host tersedia dalam beberapa bentuk termasuk fag, bakteri, ragi, tumbuhan, jamur
berserabut, serangga atau sel mamalia yang tumbuh dalam kultur dan hewan transgenik.
Pilihan terakhir dari host akan bergantung pada persyaratan yang spesifik dan aplikasi untuk
protein rekombinan. Pemilihan host tidak hanya mempengaruhi amplifikasi dan isolasi dari
protein, tetapi juga cara dimana produk kemudian dapat dimurnikan. Dalam rangka untuk
memutuskan host mana yang paling cocok dalam jumlah dan tingkat kemurnian produk serta
integritas biologis dan potensi toksisitas sebaiknya dipertimbangkan. Sebagai contoh, sistem
72
ekspresi bakteri tidak cocok jika modifikasi pasca-translasi diperlukan untuk menghasilkan
produk rekombinan yang dapat berfungsi penuh.
Lokasi produk dalam host akan mempengaruhi pilihan metode untuk isolasi dan
pemurnian dari produk. Sebagai contoh, sebuah host bakteri dapat mensekresikan protein ke
dalam media pertumbuhan, mentransportnya ke dalam ruang periplasmik atau menyimpannya
sebagai badan inklusi yang tidak dapat larut dalam sitoplasma.
Tabel 6.1. Keuntungan dan kerugian dalam pemilihan host
Host
Advantages
Bacteria
e.g.Escherichia coli
Many references
available
Disadvantages
and
much
experience
No post-translational modification
Wide choice of cloning vectors
Gene expression easily controlled
Biological activity and immunogenicity may differ
from natural protein
Easy to grow with high yields (product can
form up to 50% of total cell protein)
High endotoxin content in gram negative bacteria
Product can be designed for secretion into the
growth media
Bacteria
e.g.
Staphylococcus aureus
Secretes fusion proteins into the growth media
Does not express such high levels as E. coli
Pathogenic
Mammalian cells
Same biological activity as native proteins
Cells can be difficult and expensive to grow
Mammalian expression vectors available
Cells grow slowly
Can be grown in large scale cultures
Manipulated cells can be genetically unstable
Low productivity as compared to micro-organisms
Yeasts
Lacks detectable endotoxins
Gene expression less easily controlled
Generally Regarded As Safe (GRAS)
Glycosylation not identical to mammalian systems
Fermentation relatively inexpensive
Facilitates glycosylation and formation of
disulphide bonds
Only 0.5% native proteins are secreted so
isolation of secreted product is simplified
Well established large scale production and
downstream processing
Cultured insect cells
Baculovirus vector
Many processing mechanisms similar to
eukaryotic cells
Lack of information on glycosylation mechanisms
Safe, since few arthropods are adequate hosts
for baculovirus
Product not always fully functional
Baculovirus vector received FDA approval for
a clinical trial
Few differences in functional and antigenic properties
between product and native protein
Virus stops host protein amplification. High
level expression of product
73
Tabel 6.1. (Lanjutan) Keuntungan dan kerugian pemilihan host
Host
Advantages
Fungi
e.g.Aspergillus sp.
Disadvantages
Well established
fermentation
of filamentous fungi
systems
for
High level of expression not yet achieved
Growth inexpensive
Genetics not well characterized
A.niger is GRAS
No cloning vectors available
Can secrete large quantities of product into growth
media, source of many industrial enzymes
Plants
Low transformation efficiency
Long generation time
6.4.5 Pilihan Vektor
Dalam rangka untuk mengkloning gen yang diinginkan semua vector yang telah direkayasa
memiliki pilihan situs hilir restriksi unik dari urutan promotor transkripsi. Pilihan keluarga
vector diatur oleh host/inang nya. Setelah host telah dipilih, berbagai macam vector yang
berbeda dapat dipertimbangkan, dari ekspresi vector yang sederhana hingga vector yang
mengeluarkan/mensekresikan protein fusi.
Namun, seperti untuk pemilihan dari system host yang sesuai, pilihan terakhir dari
vector harus mempertimbangkan persyaratan khusus dari aplikasi dan tentu saja akan
dipengaruhi oleh perilaku dari protein target. Salah satu faktor kunci yang telah menyebabkan
meningkatnya penggunaan vector protein fusi adalah amplifikasi dari protein fusi yang berisi
tag dengan ukuran yang telah diketahui dan fungsi biologis sangat mudah untuk
menyederhanakan isolasi, pemurnian dan selanjutnya deteksi. Dalam beberapa kasus hasil
protein juga dapat ditingkatkan.
Pemeliharaan dan protokol kloning sangat spesifik untuk setiap vector dan petunjuk
yang diberikan oleh pemasok harus diikuti dengan hati-hati.
Table 6.2. Memberikan tinjauan beberapa fitur amplifikasi fusi protein
yang dapat
mempengaruhi pilihan terakhir dari vektor.
Advantages
Fusion proteins
Cell compartments can be targeted
Disadvantages
Tag may interfere with protein structure and
affect folding and biological activity
Provide a marker for expression
Cleavage site is not always 100% specific if tag
needs to be removed
Simple purification using affinity chromatography
under denaturing or non-denaturing conditions
Easy detection
74
Refolding achievable on a chromatography column
Ideal for secreted proteins as the product is easily
isolated from the growth media
Non- fusion proteins
No cleavage steps necessary
Purification and detection not as simple
Problems with solubility may be difficult to overcome,
reducing potential yield
6.4.6 Vektor untuk protein non-fusion
Tabel 6.3. Menunjukkan contoh vektor non-fusion
Vector
family
Comments
pTrc 99 A
Prokaryotic vector for expression of proteins encoded by inserts lacking a start codon, inducible
by IPTG
pKK223-3
For over-expression of proteins under the control of the strong tac promotor in prokaryotes
pSVK 3
For in vivo expression in mammalian cell lines
PSVL SV40
For high level transient expression in eukaryotic cells
pMSG
For inducible expression in mammalian cells
6.4.7 Vektor untuk protein fusi
Tabel 6.4. Menunjukkan contoh dari vector untuk protein fusi bersama dengan produk
pemurnian yang diperlukan.
Vector family
Tag
Purification Products
pGEX
Glutathione S-transferase
PQE
6 x Histidine
pET
6 x Histidine
GST MicroSpin™ Purification Module
GSTrap™
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
His MicroSpin Purification Module
HisTrap™
HiTrap™ Chelating
Chelating Sepharose Fast Flow
His MicroSpin Purification Module
HisTrap
HiTrap Chelating
Chelating Sepharose Fast Flow
pEZZ
18
(non-inducible
expression)
pRIT2T(expression inducible
by temperature change)
IgG binding domain of protein A
IgG Sepharose 6 Fast Flow
IgG binding domain of protein A
IgG Sepharose 6 Fast Flow
75
6.4.8 Pilihan tag fusi
Dua tag yang paling sering digunakan adalah glutathione S-transferase (GST tag) dan 6 x
residu histidine (His)6 tag. Adapun pemilihan dari host dan vector, keputusan untuk
menggunakan baik GST atau (His)6 tag harus dibuat sesuai dengan kebutuhan aplikasi
spesifik
Tabel 6.5. Menyoroti beberapa fitur kunci dari tag yang harus dipertimbangkan.
GST tag
Can be used in any expression system
Purification procedure gives high yields of pure product
Selection of purification products available for any scale
pGEX6P PreScission™ protease vectors enable cleavage
and
purification in a single step
Site-specific proteases enable cleavage of tag if required
GST tag easily detected using an enzyme assay or
an immunoassay
Simple purification. Very mild elution conditions
minimize risk of damage to functionality and
antigenicity of target protein
GST tag can help stabilize folding of recombinant
proteins
Fusion proteins form dimers
(His)6 tag
Can be used in any expression system
Purification procedure gives high yields of pure
product
Selection of purification products available for any
scale
Small tag may not need to be removed e.g. tag is
poorly
immunogenic so fusion partner can be used directly as
an antigen in antibody production
Site-specific proteases enable cleavage of tag if
required.
N.B. Enterokinase sites that enable tag cleavage
without leaving behind extra amino acids are
preferable
(His)6 tag easily detected using an immunoassay
Simple purification, but elution conditions are not as
mild as for GST fusion proteins. Purification can be
performed under denaturing conditions if required.
N.B. Neutral pH but imidazole may cause
precipitation
Desalting to remove imidazole may be necessary
(His)6 - dihydrofolate reductase tag stabilizes small
peptides during expression
Small tag is less likely to interfere with structure and
function of fusion partner
Mass determination by mass spectrometry not always
accurate for some (His)6 fusion proteins*
76
6.4.9 Penanganan badan inklusi
Amplifikasi sering dapat dikendalikan sehingga protein rekombinan terakumulasi dalam
ruang intraseluler atau disekresikan ke dalam ruang periplasmik. Sedangkan sekresi
menguntungkan dari segi protein folding, kelarutan dan oksidasi sistein, hasilnya umumnya
jauh lebih tinggi bila menggunakan ekspresi intraseluler.
Namun demikian, protein rekombinan yang terakumulasi intrasel sering diatur dalam
bentuk badan inklusi, agregat terlarut dari protein yang berkurang aktivitas biologisnya. Jadi,
sementara kehadiran badan inklusi dapat membuat langkah awal dari isolasi menjadi sangat
sederhana, isolasi protein dari badan inklusi sering menyebabkan kesulitan dengan lipatulang dari protein, mengembalikan reformasi yang benar dari ikatan disulfide dan dengan
demikian terjadi pemulihan penuh aktivitas biologis.
Tabel 6.6. Merangkum keuntungan dan kerugian dari bekerja dengan produk rekombinan
yang dinyatakan sebagai badan inklusi.
Advantages
Disadvantages
High expression levels can reduce fermentation costs
Re-folding shifts difficulties and costs downstream
Easily monitored by SDS-PAGE or immunoblotting
Amplification cannot be monitored directly
by functional assays
Cytoplasmic proteins are easily washed away
Minor contaminants are often hydrophobic, poorly
soluble membrane proteins and cell wall fragments
Major contaminants are oligomers and misfolded
Can be difficult to separate multiple forms of the
or proteolyzed forms of the protein
same protein
pL promoter with T induction often yields protein
If the protein does not fold well, another expression
where other systems fail
system will be needed
6.5 APLIKASI
Proses rekombinan protein digunakan untuk berbagai tujuan penelitian secara komersial,
medis dan ilmiah. Dapat juga digunakan pada peternakan secara komersial untuk melawan
penyakit pada ternak serta tanaman.
Rekombinan protein mempunyai peran besar dalam penciptaan bahan terapeutik yang
dapat memodifikasi dan memperbaiki kesalahan genetik, menghancurkan sel-sel kanker,
mengobati gangguan system kekebalan tubuh, dan masih banyak fungsi-fungsi lainnya.
77
Sebagai contoh, Erythropoietin, sebuah protein hormone yang diproduksi dengan teknologi
rekombinan dapat digunakan dalam merawat pasien dengan kekurangan/defisiensi eritrosit,
yang merupakan penyebab umum dari komplikasi ginjal.
Ada bidang medis yang disebut farmakologi rekombinan, dimana rekombinan protein
digunakan untuk memproduksi pengobatan DNA yang diturunkan seperti interleukins; yang
mengatur sel T, hormon pertumbuhan; digunakan untuk merangsang pertumbuhan,
eritropoietin; yang merangsang produksi sel darah merah dalam sumsum tulang, dan insulin;
digunakan untuk mengobati diabetes tipe 1. Protein rekombinan juga dapat digunakan di
laboratorium sains untuk penelitian stem cell dan penelitian kloning.
Di masa depan bioteknologi dapat menimbulkan peningkatan perkembangan dari
organ manusia di laboratorium dan produksi dari tanaman yang dapat menghasilkan pestisida
sendiri. Meskipun masih banyak perdebatan etis dan pertanyaan, teknologi rekombinan
memiliki potensi untuk merevolusi produksi pangan, perawatan kesehatan dan proses
penuaan.
Protein Rekombinan di mulai dari pertama kali saat Insulin diproduksi oleh E. coli
oleh Herbert Boyer di San Fransisco Amerika dibawah perusahaan Genentech Inc 1978.
Peristiwa ini begitu mengagetkan dunia karena dengan keberhasilan produksi protein
rekombinan tersebut merubah sebagian besar peta industri di dunia.
Bayangkan sebelum dapat diproduksi oleh E. coli insulin didapatkan dengan cara
membantai sekian ribu sapi dan babi, proses penjagalannya pun harus khusus demi menjamin
kualitas insulin yang akan disolasi dari hewan ternak tersebut. Dengan keberhasilannya
diproduksi pada E. coli maka ini akan mengurangi biaya produksi Insulin menjadi jauh
dibawah prediksi sebelumnya.
Escherichia coli adalah mikroorganisme yang paling terkait dengan berbagai bidang
bioteknologi karena bakteri inilah organisme pertama yang dipelajari secara lengkap baik dari
sisi metabolismenya, fisiologinya, regulasi genetikanya bahkan sampai sequence genomnya.
Bukan hanya karena kemudahannya untuk di manipulasi akibat lengkapnya informasi tentang
E.Coli melainkan juga karena kemudahannya untuk di kulturkan dan cepatnya proses
pertumbuhannya berlangsung dibandingkan dengan berbagai macam organisme yang lain.
Oleh karena itu E. Coli mendapatkan kehormatan menjadi organisme model yang cukup
penting dalam dunia protein rekombinan.
Proses regulasi gen yang telah lengkap dipelajari dan telah banyak dimanipulasi telah
menyebabkan E. coli menjadi organisme model yang paling banyak mempunyai variasi
pilihan untuk dijadikan host dalam proses produksi protein rekombinan
78
6.6 INSULIN REKOMBINAN
Para peneliti membuat insulin manusia rekombinan dengan struktur yang identik
denganinsulin manusia menggunakan vektor bakteri E. coli yang telah dilemahkan.
Gambar 6.3. Bakteri Escherichia coli yang digunakan sebagai hospes pembuatan protein
rekombinan
6.6.1 Bakteri Gram negatif, E. coli, penghuni alami saluran pencernaan manusia
Sejak Banting dan Best menemukan hormon insulin pada tahun 1921, pasien diabetes
mellitus yang mengalami peningkatan kadar gula darah disebabkan gangguan produksi
insulin, telah diterapi dengan menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas
hewan.
Meskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun komposisinya
sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh pasien menghasilkan antibodi
terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha menetralkan dan mengakibatkan respon
inflamasi pada tempat injeksi. Selain itu efek samping dari insulin sapi dan babi ini adalah
kekhawatiran adanya komplikasi jangka panjang dari injeksi zat asing yang rutin.
Faktor-faktor ini menyebabkan peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan
memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk
memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami diproduksi. Hal ini
telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.
79
6.6.2 Struktur insulin
Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino, 30 di
antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai kedua.
Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan disulfida.
Gambar 6.4. Struktur protein insulin manusia
Kode genetik untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas lengan pendek dari
kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam rantai
B). DNA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari
rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen. Ada
empat basa nitrogen yang berbeda yaitu adenin, timin, sitosin dan guanin. Sintesis protein
tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut yang diulang.
6.6.3 Proses produksi
Escherrichia coli (E. coli), penghuni saluran pencernaan manusia, adalah „pabrik‟ yang
digunakan dalam rekayasa genetika insulin. Ketika bakteri berreproduksi, gen insulin
direplikasi bersama dengan plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan cepat
mendegradasi protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan cara
menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini. Pada E. coli, Bgalaktosidase adalah enzim yang mengontrol transkripsi gen. Untuk membuat bakteri
memproduksi insulin, gen insulin perlu terikat pada enzim ini.
80
Gambar 6.5. Skema pembuatan insulin rekombinan
Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti
pisau bedah biologi, hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah satunya
rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan
pasangan basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik dari
kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin. Sedangkan DNA ligase
adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung nukleotida.
Gambar 6.6. Skema kerja enzim restriksi endonuklease
81
Langkah pertama pembuatan humulin adalah mensintesis rantai DNA yang membawa
sekuens nukleotida spesifik yang sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan B dari insulin.
Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua
rantai telah dipetakan. Enam puluh tiga nukleotida yang diperlukan untuk mensintesis rantai
A dan sembilan puluh untuk rantai B, ditambah kodon pada akhir setiap rantai yang
menandakan pengakhiran sintesis protein.
Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di setiap
awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu.
„Gen‟ sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk
enzim bakteri, B-galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid vektor tersebut. Pada tahap ini,
sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan Bgalaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli.
6.7. Mikroskopis plasmid E. coli dengan mikroskop elektron
Praktis penggunaan teknologi DNA rekombinan dalam sintesis insulin manusia
membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin
dalam rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersama dengan sel
mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis.
82
6.8. Skema pembentukan insulin rekombinan pada kultur E. coli
Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu
rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen Bgalaktosidase dan dimurnikan.
Gambar 6.9. Struktur beta galaktosidase rantai A dan rantai B yang telah dimurnikan
Kedua
rantai
dicampur
dan
dihubungkan kembali dalam reaksi yang
membentuk
menghasilkan
jembatan
Humulin
silang
murni
disulfida,
(insulin
manusia sintetis).
Gambar 6.10. ikatan disulfida yang terbentuk pada dua rantai protein insulin A dan B
83
6.6.4 Implikasi biologis dari rekayasa genetika Humulin rekombinan
Humulin merupakan protein hewani yang dibuat dari bakteri sedemikian rupa sehingga
strukturnya benar-benar identik dengan molekul alami. Hal ini akan mengurangi
kemungkinan komplikasi yang disebabkan produksi antibodi oleh tubuh manusia. Dalam
studi kimia dan farmakologi, insulin rekombinan DNA manusia yang diproduksi secara
komersil telah terbukti bisa dibedakan dari insulin pankreas manusia.
Awalnya, kesulitan utama yang dihadapi adalah kontaminasi produk akhir oleh sel
inang, sehingga meningkatkan resiko kontaminasi dalam kaldu fermentasi. Bahaya ini diatasi
dengan ditemukannya proses pemurnian. Ketika dilakukan tes pada produk akhir insulin,
termasuk teknik terbaik radio-immuno assay, tidak ada „kotoran‟ yang terdeteksi.
Seluruh prosedur, sekarang dilakukan dengan menggunakan sel ragi sebagai media
pertumbuhan, karena sel ragi dapat menghasilkan sebuah molekul insulin manusia yang
hampir lengkap dengan struktur tiga dimensi yang sempurna. Ini meminimalkan kebutuhan
untuk prosedur pemurnian kompleks dan mahal.
6.7. Hormon Pertumbuhan rekombinan untuk memacu pertumbuhan ikan gurame
(Osphronemus gouramy)
Ikan gurame (Osphronemus gouramy) merupakan salah spesies target revitalisasi perikanan
untuk tujuan konsumsi dalam negeri, yang diharapkan produksinya terus meningkat setiap
tahun. Target produksi ikan gurame nasional tahun 2007 belum tercapai (Nurdjana, 2008).
Rendahnya kualitas benih dan pakan yang digunakan petani ikan diduga merupakan faktor
utama penyebab target produksi nasional tersebut tidak terealisasi.
Kualitas benih ikan dapat ditingkatkan melalui aplikasi metode selektif breeding,
hibridisasi, poliploidisasi (triploidisasi), dan transgenesis. Namun demikian, teknik pemijahan
ikan gurame secara terkontrol/buatan sebagai prasyarat bagi teknologi-teknologi tersebut
belum tersedia. Pendekatan lain yang bisa digunakan untuk memacu pertumbuhan ikan
gurame adalah pemberian pakan berkualitas tinggi; kadar protein tinggi. Pakan buatan untuk
memacu pertumbuhan ikan gurame mulai dari benih hingga untuk pembesaran disarankan
menggunakan kadar protein tinggi, 33,9-43,3% (Mokoginta et al., 1994).
Persentase kadar protein yang cukup tinggi tersebut, diduga menjadi salah satu
penyebab petani kurang tertarik untuk menggunakannya, karena pakan yang memiliki protein
tinggi adalah lebih mahal dibandingkan dengan pakan dengan kandungan protein rendah.
Umumnya petani memberi makan ikan gurame berupa pakan buatan yang mengandung
protein <30% atau dengan daun talas saja. Pakan dengan kadar protein rendah, sekitar 28%,
84
yang ditambahkan bahan stimulan pemacu pertumbuhan ikan, atau pemberian pakan alami
diperkaya dengan bahan stimulan tersebut diduga menjadi alternatif untuk mengatasi masalah
rendahnya kecepatan tumbuh ikan gurame.
6.8. REFERENSI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Anonim, The Recombinant Protein Handbook, Protein Amplification and Simple Purification,
Edition AA, Amersham Pharmacia Biotech, page 6-8; 57
http://www.dnassequencing.com/category/recombinant-protein-images/
Kayser, O., dan Muller, R.H. (2004). Pharmaceutical Biotechnology; Drug Discovery and
Clinical Applications. Willey-VCH: German.
Production of Recombinant Protein, http://www.ehow.com/about_5366348_productionrecombinant-protein.html
Recombinant Protein Definition, http://www.ehow.com/about_5407160_recombinant-proteindefinition.html
Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Kanisius: Yogyakarta. 151-178.
What Are Recombinant Proteins?, http://www.ehow.com/info_8131260_recombinantproteins.html
85