E. coli, Saccharomyces cerevisiae

Erna Hayati, dr., MM., M.Si.
Fira Amaris, dr., M.Si.
Hertina Silaban, dr., M.Si.
Marrisa, dr., M.Si.
Nizmawardini Yaman, dr., M.Kes., M.Si
Ratna Asih S.R., dr., M.Si.
Zizi Tamara, dr., M.Si.
Budi Utami, S.Si., M.Si.
Isabella, dr., M.Si.
PENDAHULUAN
• Aplikasi bioteknologi dalam dunia farmasi
• Untuk memproduksi produk-produk yang
penting dan bermanfaat (obat, enzim, protein)
REKAYASA GENETIKA
• Adalah proses pembentukan rekombinan baru
dari material genetik dengan cara penyisipan
suatu molekul asam nukleat asing (yang
dihasilkan di luar sel) ke dalam suatu vektor,
sehingga, memungkinkan penggabungan dan
kelanjutan berkembang/ diperbanyak di
dalam sel inang yang baru.
KLON
adalah organisme identik yang terbentuk secara
genetik dan membawa seluruh potongan DNA
yang telah disisipkan, dan memperbanyak
molekul yang baru.
Isolasi DNA
Pemotongan DNA
Transformasi
Penyambungan DNA
TAHAPAN
Introduksi ke sel inang
Isolasi DNA
Lisozim/EDTA/triton-x
sentrifugasi
Purifikasi DNA
Fenol-kloroform/
Sentrigugasi gradien Etidium
bromida
sedot
• Sebagai mekanisme pertahanan terhadap
infeksi virus DNA
• Memotong didalam utasan DNA
(endonuklease)
• Setiap enzim mendigesti pada sekuens spesifik
(restriksi)
• Mengenali 4-6 pasang basa palindromik
EcoRI
Sisi pemotongan
EcoRI
Escherichia coli
Sisi 5’
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
PstI
Providancia stuartii
Sisi 3’
5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
Transformasi
Transfeksi
Mikroinjeksi
Mikroproyektil
Electroporation
Electrical shock yang menyebabkan membran
menjadi permeabel terhadap DNA
Calcium Chloride/Heat Shock
Peningkatan suhu dan CaCl2  heat shock pada
37oC – 42oC, dalam larutan CaCl2
E.coli kompeten
Elektroforasi
VEKTOR KLONING
1. Dapat bereplikasi sendiri (punya ori)
2. Untai ganda
3. Memiliki minimal 2 marker
Macam-macam vektor
•
•
•
•
•
•
•
•
Plasmid
Bakteriofag
Kosmid
Fasmid
YACs
Yaps
Ti Agrobacterium tumafacien
Baculovirus
•
•
•
•
Komposisi medium
Kadar CO2
Keasaman medium
Suhu inkubasi
SINTESIS VITAMIN C
Acetobacter
Gluconobacter
Erwinia
Corynebacterium
Brevibacterium
Arthrobacter
D-glukosa  2,5-DKG
Beberapa lintasan metabolisme
2,5-DKG
reduktase
2,5-DKG
2-KLG
1 lintasan metabolisme
Gen penyandi enzim 2,5-DKG reduktase dari
Corynebacterium diklon kedalam Erwinia
MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBIOTIK
• Fermentasi oleh Streptomyces spp  AB
• Lama kelamaan O2 <<  produksi AB <<
• Vitreoscilla spp (bakteri anaerob yang dapat tumbuh
pada keadaan miskin O2)
• Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem
homodimerik yang berfungsi mirip dengan hemoglobin
eukariot, yaitu dapat mengikat O2 dari medium
kemudian menyalurkannya ke dalam sel.
• Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon
di Streptomyces
Isolasi cDNA
Rekayasa
Optimalisasi
Strategi untuk
mendisain protein
dengan cara
mengatur kombinasi,
mutagenesis terarah
Sistem ekspresi
berbeda-beda
Optimalisasi
Kriteria:
• Memproduksi protein heterolog yang mirip
dengan protein yang diinginkan
• Mamppu tumbuh dengan densitas sel yang
tinggi
• Mudah dipurifikasi
• Produksi paling baik (human-interleukin-3 baik
pada Bacillus licheniformis), jika di E. coli 
banyak kesalahan
Rantai A
Rantai B
Ikatan
disulfida
INSULIN REKOMBINAN
• Memasukkan gen penyandi insulin manusia
kedalam bakteri E. coli
• Kultivasi  protein insulin
• Isolasi dan purifikasi protein rekombinan tsb
PROTEIN REKOMBIN
•
•
•
•
•
•
Hormon pemacu folikel rekombinan (CHO)
Aktivator plasminogen tipt jaringan (CHO)
Faktor VIII rekombinan (CHO)
Interleukin rekombinan (E. coli)
Interferon rekombinan (E. coli)
Faktor pertumbuhan hematopoietik
rekombinan (E. coli, Saccharomyces cerevisiae,
CHO, BHK)
VAKSIN
GENERASI I
Mgd organisme hidup yang dilemahkan  bahaya
GENERASI II
Mgd mikroorganisme yang telah dimatikan dgn
formalin/fenol
GENERASI III
Vaksin rekombinan  relatif lebih aman
VAKSIN
REKOMBINAN
SISTEM PENGHANTARAN
LIPOSOM
LIPOPROTEIN
Prinsip kerja liposom
ANTIBODI
MONOKLONAL
Tipe-tipe antibodi
monoklonal
Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC)
Complement dependent cytotoxicity (CDC)
Inhibitor GFR
Antibodi directed enzyme prodrug therapy (ADEPT)
Transtuzumab®
Mengikat HER2-RTK
Cetuximab®
Mengikat EGFR
Bevacizumab®
Mengikat VEGF