Resume of Journal

Resume of Journal
PRINSIP PEMISAHAN ASAM NUKLEAT
OLEH ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE
Muhittin Yılmaz*, Cem Ozic and İlhami Gok
University of Kafkas, Department of Biology, Faculty of Sciences, Kars,
Turkey
A. LATAR BELAKANG
Elektroforesis asam nukleat dapat dideteksi dengan pewarnaan dan
divisualisasikan di bawah 300 nm sinar UV. Pewarnaan dan visualisasi DNA
yang baik dilakukan dengan menggunakan etidium bromida ataupun Green
SYBR. Metode yang paling nyaman dan umum digunakan untuk
memvisualisasikan DNA dalam gel agarose adalah etidium bromida. Etidium
bromida dapat digunakan untuk mendeteksi baik asam nukleat tunggal
maupun double-stranded (DNA dan RNA). Namun, resolusi beruntai tunggal
asam
nukleat
yang
relatif
rendah
menghasilkan
visualisasi
buruk
dibandingkan dengan Green SYBR. Pada kenyataannya, sebagian besar
terkait dengan fluoresensi pewarnaan DNA beruntai tunggal atau RNA
disebabkan pengikatan pewarna pendek intrastrand kopel dalam molekul
(Sambrook & Russel 2001). Pola pita DNA diselesaikan melalui gel dengan
gambar yang direkam. Gambar etidium bromida gel bernoda dapat ditangkap
dengan ditransmisikan menggunakan cahaya insiden UV. Namun, jumlah
gambar DNA jauh lebih rendah pada 302 nm dibandingkan dengan 254 nm.
Jika SYBR Hijau digunakan sebagai pengganti ethidium bromida kisaran
kemungkinan peningkatan 10-20-kali lipat dalam sensitivitas menggunakan
citra konvensional. Deteksi DNA diwarnai dengan pewarna ini memerlukan
penggunaan gelatin kuning atau hijau atau plastik filter dengan kamera
bersama dengan pencahayaan dengan 300-nm sinar UV. Untuk itu perlu
adanya analisis khusus mengenai dasar pewarnaan dan visualisasi yang baik
dalam teknik elektroforesis gel agarosa.
Resume of Journal
B. MANFAAT
Elektroforesis gel agarosa secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran
fragmen DNA setelah mencerna dengan enzim restriksi, misalnya dalam
pemetaan pembatasan DNA kloning. Juga menjadi alat rutin dalam diagnosis
genetika molekuler atau sidik jari genetik melalui analisis produk PCR. Sebelum
blot Selatan pemisahan genomik DNA terbatas dan pemisahan RNA sebelum blot
utara juga tergantung pada elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis Agarosa gel
umumnya digunakan untuk menyelesaikan DNA melingkar dengan berbagai
supercoil topologi, dan untuk menyelesaikan fragmen yang berbeda karena
sintesis DNA. Kerusakan DNA akibat peningkatan silang proporsional
mengurangi migrasi DNA elektroforesis (Blasiak et al, 2000;. Lu & Morimoto,
2009). Selain menyediakan media yang tepat untuk analisis ukuran fragmen, gel
agarosa memungkinkan pemurnian fragmen DNA. Peningkatan konsentrasi gel
agarosa yang mengurangi kecepatan migrasi dan dengan demikian membuat lebih
mudah memisahkan molekul DNA yang lebih kecil.
C. METODE
Beberapa buffer elektroforesis dapat digunakan untuk fraksionasi asam
nukleat seperti Trisacetate-EDTA (TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE), dan TAE
gel. Dimana TAE buffer lebih mudah daripada TBE. Metode pemisahan adalah
tujuan akhir dari menjalankan gel (Rapley, 2000). Untuk persiapan gel, bubuk
elektroforesis agarosa dicampur dengan buffer elektroforesis sesuai dengan
konsentrasi yang diinginkan (biasanya dengan kisaran 0,5-2%) kemudian
dipanaskan dalam oven microwave. Etidium bromida biasanya ditambahkan ke
gel pada konsentrasi 0,5 ug / ml untuk visualisasi asam nukleat. Campuran ini
didinginkan sampai 600oC dan dituangkan ke dalam pengecoran tray untuk
pemadatan. Segera setelah pembekuan gel, sisir dihapus. Gel disimpan dalam
plastik selama elektroforesis dan produk PCR dicampur dengan memuat dye yang
ditempatkan di sumur. Pada asam nukleat yang bermuatan negatif, sumur harus
ditempatkan menuju elektroda negatif. Pada saat yang sama, etidium bromida
bermigrasi di arah sebaliknya, bertemu dan berpasangan dengan fragmen DNA.
Fragmen DNA yang divisualisasikan oleh pewarnaan etidium bromida saat
Resume of Journal
migrasi yang memadai telah terjadi. Kemudian, hal ini neon dye interkalasi antara
dasar DNA dan RNA (Corley, 2005). Fragmen DNA linier bermigrasi melalui gel
agarosa dengan kecepatan yang terbalik sebanding dengan log10 berat molekul
mereka (Sambrook & Russel, 2001). Plasmid bermigrasi dalam gel agarosa
berbeda dibandingkan dengan DNA linier yang ukurannya sama. Biasanya,
plasmid dipotong dan akan bermigrasi lebih cepat daripada plasmid yang sama
ketika linearisasi (Sambrook & Russel, 2001). Faktor-faktor yang tercantum di
bawah ini mempengaruhi mobilitas fragmen DNA pada gel agarosa :
1. BAHAN
Asam Nukleat dan oligonukleotida, DNA sampel, standar ukuran DNA
dan produk PCR
Buffer dan Larutan; Agarose solusi, Elektroforesis
penyangga, DNA solusi pewarnaan dan 6x Gel-loading penyangga DNA
Pewarnaan Solusi, Ethidium bromida (10 mg / ml) atau SYBR Hijau.
Etidium bromida: Tambahkan 1 g ethidium bromida ke dalam 100 ml
H2O. Aduk pada magnet
pengaduk selama beberapa jam untuk
memastikan bahwa pewarna telah dibubarkan. Bungkus wadah dalam
aluminium foil atau mentransfer solusi% 1 (10 mg / ml) ke botol gelap dan
toko di kamar temperatur. Etidium bromida adalah mutagen kuat dan
beracun. SYBR Hijau: SYBR Hijau (Probe Molekuler) diberikan sebagai
solusi stok diketahui konsentrasi dalam dimetilsulfoksida. Gel agarosa
berwarna dalam larutan kerja SYBR Green, yang merupakan pengenceran
1:10.000 asam nukleat Hijau SYBR noda di elektroforesis penyangga.
Siapkan bekerja stok SYBR Hijau harian dan simpan dalam gelap di ruang
diatur temperatur.
2. ELEKTROFORESIS BUFFER, TAE, TPE DAN TBE
 TAE : Siapkan larutan stok 10x dalam 1 liter H2O: 48,4 g, 11,4 ml
asam asetat glasial (17,4 M) 20 ml dari 0,5 M EDTA atau 3,7 g
EDTA, dan garam dinatrium. Larutkan semua dalam 800 ml air
deionisasi dan massa sampai dengan 1 liter, simpan dalam suhu
kamar dan diencerkan untuk 1X sebelum penggunaan.
 TBE : Siapkan larutan stok 10x dalam 1 liter H2O: 48,4 g, 55 g
asam borat 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0)
Resume of Journal
 TPE; Siapkan larutan stok 10x dalam 1 liter H2O: 108 g, 15,5 ml
dari 85% (1,679 g / ml) asam fosfat 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0)
3. KONSENTRASI AGAROSE
Elektroforesis gel agarosa dapat digunakan untuk pemisahan fragmen
DNA mulai dari 50 pasangan basa ke beberapa basis mega (Mb) dengan
menggunakan alat khusus. Dalam gel, jarak pita DNA antara dari panjang
yang diberikan ditentukan oleh persen agarosa. Konsentrasi tertinggi
memiliki kelemahan jangka panjang. PFGE digunakan untuk memisahkan
tinggi Mw dengan menerapkan tegangan yang berbeda. Kebanyakan gel
agarosa disiapkan dengan konsentrasi agarosa berkisar 0,7% (baik
pemisahan atau resolusi besar 5-10kb fragmen DNA) sampai 2% (resolusi
0,2-fragmen 1kb) (Tabel 1 - Lewis, 2011).
4. TEGANGAN
Migrasi dari fragmen dalam gel agarosa tergantung pada perbedaan arus
listrik. Tegangan yang optimal yang berbeda diperlukan untuk ukuran
fragmen yang berbeda. Misalnya, resolusi yang terbaik untuk fragmen
yang lebih besar dari 2 kb dapat diperoleh dengan menerapkan tidak lebih
dari 5volt per cm ke gel.
5. ELEKTROFORESIS PENYANGGA
Berbagai buffer digunakan untuk elektroforesis agarosa. Dua yang paling
umum untuk buffer Asam nukleat adalah Tris / Asetat / EDTA (TAE) dan
Tris / Borat / EDTA (TBE). Fragmen DNA bermigrasi dengan tingkat
yang berbeda dalam dua buffer karena perbedaan kekuatan ion. Buffer
tidak hanya mendirikan pH yang ideal, tetapi memberikan ion untuk
mendukung konduktivitas. Secara umum, penyangga yang ideal harus
menghasilkan
lebih
sedikit
panas,
memiliki
umur
panjang
dan
konduktivitas yang baik. Misalnya, penyimpangan dari konsentrasi
optimal buffer (lebih terkonsentrasi) bisa menghasilkan cukup panas untuk
melelehkan gel.
Resume of Journal
Kedua buffer bervariasi sesuai dengan kelebihan dan kekurangan. Misalnya, borat
memiliki kelemahan karena berpolimerisasi dan / atau berinteraksi dengan diol cis
ditemukan pada RNA. TAE pada sisi lain memiliki kapasitas buffer terendah
tetapi memberikan resolusi terbaik untuk lebih besar DNA yang menunjukkan
kebutuhan untuk tegangan rendah dan lebih banyak waktu dengan produk yang
lebih baik. Lithium Borat (LB) - relatif buffer baru dan tidak efektif dalam
menyelesaikan fragmen yang lebih besar dari 5 kbp. Namun, dengan
konduktivitas rendah, tegangan yang lebih tinggi dapat digunakan (sampai dengan
35V/cm) dan tegangan tinggi ini menyebabkan waktu analisis yang lebih pendek
untuk elektroforesis rutin.
D. PRINSIP DAN CARA KERJA

Prinsip Kerja :
Elektroforesis gel agarosa adalah metode yang biasa digunakan untuk
memisahkan protein, DNA atau RNA (Kryndushkin et al, 2003.). Molekul
asam nukleat adalah dipisahkan oleh bantuan medan listrik di mana
molekul bermuatan negatif bermigrasi ke arah anoda (positif). Aliran
migrasi hanya ditentukan oleh berat molekul kecil di mana berat badan
molekul bermigrasi lebih cepat daripada yang lebih besar (Sambrook &
Resume of Journal
Russel 2001). Selain pemisahan ukurannya, fraksinasi asam nukleat
menggunakan elektroforesis gel agarosa dapat menjadi langkah awal untuk
pemurnian lanjut dari sebuah band.
Dalam rangka untuk memvisualisasikan molekul asam nukleat dalam gel
agarosa, umumnya digunakan pewarna hijau etidium bromida atau SYBR.
Kemudian digunakan penerangan dari gel agarosa dengan 300-nm sinar
UV untuk memvisualisasikan asam nukleat bernoda. Elektroforesis gel
agarosa memberikan keuntungan ganda yang membuatnya sangat populer.

Cara Kerja :
1. Siapkan larutan agarose dalam buffer elektroforesis pada
konsentrasi yang tepat untuk memisahkan fragmen ukuran tertentu
yang diharapkan dalam sampel DNA.
2. Jika menggunakan botol kaca sebaiknya ditutup. Panaskan
campuran dalam air mendidih atau microwave oven sampai
agarosa larut.
3. Gunakan sarung tangan insulasi untuk mentransfer labu ke dalam
bak air pada 55°C. Ketika gel meleleh telah didinginkan,
tambahkan etidium bromida untuk konsentrasi akhir 0,5 mg / ml.
Campur gel menyeluruh oleh dengan hati-hati.
Resume of Journal
4. Sementara agarosa didinginkan, memilih sisir yang tepat untuk
membentuk sampel slot di gel. Posisikan mm 0,5-1,0 sisir di atas
piring sehingga lengkap juga terbentuk ketika agarosa ditambahkan
ke cetakan.
5. Tuangkan larutan agarosa hangat ke dalam cetakan.
6. Biarkan gel untuk polimerisasi benar (20-45 menit pada suhu
kamar),
kemudian
tuangkan
sejumlah
kecil
penyangga
elektroforesis di atas gel, dan hati-hati menghapus sisir. Tuangkan
dari buffer elektroforesis dan hati-hati menghapus rekaman itu.
Gunung gel dalam tangki elektroforesis.
7. Tempatkan gel ke dalam perangkat elektroforesis dan buffer
elektroforesis cukup untuk menutupi gel hingga kedalaman sekitar.
1 mm.
8. Campur sampel dengan memuat dye dengan 1:5 ransum atau 1:10.
9. Perlahan memuat campuran sampel ke dalam slot dari gel
terendam menggunakan pakai mikropipet, sebuah micropipettor
otomatis, atau berlarut-larut Pasteur pipet atau gelas kapiler tabung.
Memuat standar ukuran ke dalam slot pada kedua sisi kanan dan
kiri dari gel.
10. Tutup tutup tangki gel dan melampirkan mengarah listrik sehingga
DNA akan bermigrasi menuju anoda positif (lead merah).
Terapkan tegangan 1-5V/cm. Jika lead memiliki telah terpasang
dengan benar, gelembung harus dihasilkan pada anoda dan katoda,
dan dalam beberapa menit, biru bromofenol harus bermigrasi dari
sumur ke tubuh gel. Jalankan gel sampai biru bromofenol dan FF
cyanol xilena memiliki bermigrasi untuk jarak melalui sering ke og
ketiga terakhir gel.
11. Ketika sampel DNA atau pewarna telah bermigrasi untuk jarak
yang cukup melalui gel, mematikan arus listrik dan menghapus
memimpin dan tutup dari tangki gel. Jika tidak, noda gel dengan
cara merendam dalam penyangga elektroforesis atau etidium
mengandung H2O bromida (0,5 mg / ml) selama 20-45 menit pada
Resume of Journal
suhu kamar atau dengan merendam dalam 1:10.000 -lipat
pengenceran larutan stok SYBR Hijau dalam buffer elektroforesis.
E. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN

Kelebihan :
1.
Sampel dapat dengan mudah dipulihkan dan diekstrak dari gel untuk
studi lanjut.
2.
Keuntungan lain adalah bahwa gel yang dihasilkan dapat disimpan
dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan

Kekurangan :
Mungkin ada batas, tetapi tergantung pada buffer selama elektroforesis
untuk menghasilkan listrik yang cocok dan untuk mengurangi panas yang
dihasilkan oleh arus listrik dapat dianggap sebagai keterbatasan teknik
elektroforesis