Resume of Journal
advertisement
Resume of Journal PRINSIP PEMISAHAN ASAM NUKLEAT OLEH ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE Muhittin Yılmaz*, Cem Ozic and İlhami Gok University of Kafkas, Department of Biology, Faculty of Sciences, Kars, Turkey A. LATAR BELAKANG Elektroforesis asam nukleat dapat dideteksi dengan pewarnaan dan divisualisasikan di bawah 300 nm sinar UV. Pewarnaan dan visualisasi DNA yang baik dilakukan dengan menggunakan etidium bromida ataupun Green SYBR. Metode yang paling nyaman dan umum digunakan untuk memvisualisasikan DNA dalam gel agarose adalah etidium bromida. Etidium bromida dapat digunakan untuk mendeteksi baik asam nukleat tunggal maupun double-stranded (DNA dan RNA). Namun, resolusi beruntai tunggal asam nukleat yang relatif rendah menghasilkan visualisasi buruk dibandingkan dengan Green SYBR. Pada kenyataannya, sebagian besar terkait dengan fluoresensi pewarnaan DNA beruntai tunggal atau RNA disebabkan pengikatan pewarna pendek intrastrand kopel dalam molekul (Sambrook & Russel 2001). Pola pita DNA diselesaikan melalui gel dengan gambar yang direkam. Gambar etidium bromida gel bernoda dapat ditangkap dengan ditransmisikan menggunakan cahaya insiden UV. Namun, jumlah gambar DNA jauh lebih rendah pada 302 nm dibandingkan dengan 254 nm. Jika SYBR Hijau digunakan sebagai pengganti ethidium bromida kisaran kemungkinan peningkatan 10-20-kali lipat dalam sensitivitas menggunakan citra konvensional. Deteksi DNA diwarnai dengan pewarna ini memerlukan penggunaan gelatin kuning atau hijau atau plastik filter dengan kamera bersama dengan pencahayaan dengan 300-nm sinar UV. Untuk itu perlu adanya analisis khusus mengenai dasar pewarnaan dan visualisasi yang baik dalam teknik elektroforesis gel agarosa. Resume of Journal B. MANFAAT Elektroforesis gel agarosa secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran fragmen DNA setelah mencerna dengan enzim restriksi, misalnya dalam pemetaan pembatasan DNA kloning. Juga menjadi alat rutin dalam diagnosis genetika molekuler atau sidik jari genetik melalui analisis produk PCR. Sebelum blot Selatan pemisahan genomik DNA terbatas dan pemisahan RNA sebelum blot utara juga tergantung pada elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis Agarosa gel umumnya digunakan untuk menyelesaikan DNA melingkar dengan berbagai supercoil topologi, dan untuk menyelesaikan fragmen yang berbeda karena sintesis DNA. Kerusakan DNA akibat peningkatan silang proporsional mengurangi migrasi DNA elektroforesis (Blasiak et al, 2000;. Lu & Morimoto, 2009). Selain menyediakan media yang tepat untuk analisis ukuran fragmen, gel agarosa memungkinkan pemurnian fragmen DNA. Peningkatan konsentrasi gel agarosa yang mengurangi kecepatan migrasi dan dengan demikian membuat lebih mudah memisahkan molekul DNA yang lebih kecil. C. METODE Beberapa buffer elektroforesis dapat digunakan untuk fraksionasi asam nukleat seperti Trisacetate-EDTA (TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE), dan TAE gel. Dimana TAE buffer lebih mudah daripada TBE. Metode pemisahan adalah tujuan akhir dari menjalankan gel (Rapley, 2000). Untuk persiapan gel, bubuk elektroforesis agarosa dicampur dengan buffer elektroforesis sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan (biasanya dengan kisaran 0,5-2%) kemudian dipanaskan dalam oven microwave. Etidium bromida biasanya ditambahkan ke gel pada konsentrasi 0,5 ug / ml untuk visualisasi asam nukleat. Campuran ini didinginkan sampai 600oC dan dituangkan ke dalam pengecoran tray untuk pemadatan. Segera setelah pembekuan gel, sisir dihapus. Gel disimpan dalam plastik selama elektroforesis dan produk PCR dicampur dengan memuat dye yang ditempatkan di sumur. Pada asam nukleat yang bermuatan negatif, sumur harus ditempatkan menuju elektroda negatif. Pada saat yang sama, etidium bromida bermigrasi di arah sebaliknya, bertemu dan berpasangan dengan fragmen DNA. Fragmen DNA yang divisualisasikan oleh pewarnaan etidium bromida saat Resume of Journal migrasi yang memadai telah terjadi. Kemudian, hal ini neon dye interkalasi antara dasar DNA dan RNA (Corley, 2005). Fragmen DNA linier bermigrasi melalui gel agarosa dengan kecepatan yang terbalik sebanding dengan log10 berat molekul mereka (Sambrook & Russel, 2001). Plasmid bermigrasi dalam gel agarosa berbeda dibandingkan dengan DNA linier yang ukurannya sama. Biasanya, plasmid dipotong dan akan bermigrasi lebih cepat daripada plasmid yang sama ketika linearisasi (Sambrook & Russel, 2001). Faktor-faktor yang tercantum di bawah ini mempengaruhi mobilitas fragmen DNA pada gel agarosa : 1. BAHAN Asam Nukleat dan oligonukleotida, DNA sampel, standar ukuran DNA dan produk PCR Buffer dan Larutan; Agarose solusi, Elektroforesis penyangga, DNA solusi pewarnaan dan 6x Gel-loading penyangga DNA Pewarnaan Solusi, Ethidium bromida (10 mg / ml) atau SYBR Hijau. Etidium bromida: Tambahkan 1 g ethidium bromida ke dalam 100 ml H2O. Aduk pada magnet pengaduk selama beberapa jam untuk memastikan bahwa pewarna telah dibubarkan. Bungkus wadah dalam aluminium foil atau mentransfer solusi% 1 (10 mg / ml) ke botol gelap dan toko di kamar temperatur. Etidium bromida adalah mutagen kuat dan beracun. SYBR Hijau: SYBR Hijau (Probe Molekuler) diberikan sebagai solusi stok diketahui konsentrasi dalam dimetilsulfoksida. Gel agarosa berwarna dalam larutan kerja SYBR Green, yang merupakan pengenceran 1:10.000 asam nukleat Hijau SYBR noda di elektroforesis penyangga. Siapkan bekerja stok SYBR Hijau harian dan simpan dalam gelap di ruang diatur temperatur. 2. ELEKTROFORESIS BUFFER, TAE, TPE DAN TBE TAE : Siapkan larutan stok 10x dalam 1 liter H2O: 48,4 g, 11,4 ml asam asetat glasial (17,4 M) 20 ml dari 0,5 M EDTA atau 3,7 g EDTA, dan garam dinatrium. Larutkan semua dalam 800 ml air deionisasi dan massa sampai dengan 1 liter, simpan dalam suhu kamar dan diencerkan untuk 1X sebelum penggunaan. TBE : Siapkan larutan stok 10x dalam 1 liter H2O: 48,4 g, 55 g asam borat 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0) Resume of Journal TPE; Siapkan larutan stok 10x dalam 1 liter H2O: 108 g, 15,5 ml dari 85% (1,679 g / ml) asam fosfat 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0) 3. KONSENTRASI AGAROSE Elektroforesis gel agarosa dapat digunakan untuk pemisahan fragmen DNA mulai dari 50 pasangan basa ke beberapa basis mega (Mb) dengan menggunakan alat khusus. Dalam gel, jarak pita DNA antara dari panjang yang diberikan ditentukan oleh persen agarosa. Konsentrasi tertinggi memiliki kelemahan jangka panjang. PFGE digunakan untuk memisahkan tinggi Mw dengan menerapkan tegangan yang berbeda. Kebanyakan gel agarosa disiapkan dengan konsentrasi agarosa berkisar 0,7% (baik pemisahan atau resolusi besar 5-10kb fragmen DNA) sampai 2% (resolusi 0,2-fragmen 1kb) (Tabel 1 - Lewis, 2011). 4. TEGANGAN Migrasi dari fragmen dalam gel agarosa tergantung pada perbedaan arus listrik. Tegangan yang optimal yang berbeda diperlukan untuk ukuran fragmen yang berbeda. Misalnya, resolusi yang terbaik untuk fragmen yang lebih besar dari 2 kb dapat diperoleh dengan menerapkan tidak lebih dari 5volt per cm ke gel. 5. ELEKTROFORESIS PENYANGGA Berbagai buffer digunakan untuk elektroforesis agarosa. Dua yang paling umum untuk buffer Asam nukleat adalah Tris / Asetat / EDTA (TAE) dan Tris / Borat / EDTA (TBE). Fragmen DNA bermigrasi dengan tingkat yang berbeda dalam dua buffer karena perbedaan kekuatan ion. Buffer tidak hanya mendirikan pH yang ideal, tetapi memberikan ion untuk mendukung konduktivitas. Secara umum, penyangga yang ideal harus menghasilkan lebih sedikit panas, memiliki umur panjang dan konduktivitas yang baik. Misalnya, penyimpangan dari konsentrasi optimal buffer (lebih terkonsentrasi) bisa menghasilkan cukup panas untuk melelehkan gel. Resume of Journal Kedua buffer bervariasi sesuai dengan kelebihan dan kekurangan. Misalnya, borat memiliki kelemahan karena berpolimerisasi dan / atau berinteraksi dengan diol cis ditemukan pada RNA. TAE pada sisi lain memiliki kapasitas buffer terendah tetapi memberikan resolusi terbaik untuk lebih besar DNA yang menunjukkan kebutuhan untuk tegangan rendah dan lebih banyak waktu dengan produk yang lebih baik. Lithium Borat (LB) - relatif buffer baru dan tidak efektif dalam menyelesaikan fragmen yang lebih besar dari 5 kbp. Namun, dengan konduktivitas rendah, tegangan yang lebih tinggi dapat digunakan (sampai dengan 35V/cm) dan tegangan tinggi ini menyebabkan waktu analisis yang lebih pendek untuk elektroforesis rutin. D. PRINSIP DAN CARA KERJA Prinsip Kerja : Elektroforesis gel agarosa adalah metode yang biasa digunakan untuk memisahkan protein, DNA atau RNA (Kryndushkin et al, 2003.). Molekul asam nukleat adalah dipisahkan oleh bantuan medan listrik di mana molekul bermuatan negatif bermigrasi ke arah anoda (positif). Aliran migrasi hanya ditentukan oleh berat molekul kecil di mana berat badan molekul bermigrasi lebih cepat daripada yang lebih besar (Sambrook & Resume of Journal Russel 2001). Selain pemisahan ukurannya, fraksinasi asam nukleat menggunakan elektroforesis gel agarosa dapat menjadi langkah awal untuk pemurnian lanjut dari sebuah band. Dalam rangka untuk memvisualisasikan molekul asam nukleat dalam gel agarosa, umumnya digunakan pewarna hijau etidium bromida atau SYBR. Kemudian digunakan penerangan dari gel agarosa dengan 300-nm sinar UV untuk memvisualisasikan asam nukleat bernoda. Elektroforesis gel agarosa memberikan keuntungan ganda yang membuatnya sangat populer. Cara Kerja : 1. Siapkan larutan agarose dalam buffer elektroforesis pada konsentrasi yang tepat untuk memisahkan fragmen ukuran tertentu yang diharapkan dalam sampel DNA. 2. Jika menggunakan botol kaca sebaiknya ditutup. Panaskan campuran dalam air mendidih atau microwave oven sampai agarosa larut. 3. Gunakan sarung tangan insulasi untuk mentransfer labu ke dalam bak air pada 55°C. Ketika gel meleleh telah didinginkan, tambahkan etidium bromida untuk konsentrasi akhir 0,5 mg / ml. Campur gel menyeluruh oleh dengan hati-hati. Resume of Journal 4. Sementara agarosa didinginkan, memilih sisir yang tepat untuk membentuk sampel slot di gel. Posisikan mm 0,5-1,0 sisir di atas piring sehingga lengkap juga terbentuk ketika agarosa ditambahkan ke cetakan. 5. Tuangkan larutan agarosa hangat ke dalam cetakan. 6. Biarkan gel untuk polimerisasi benar (20-45 menit pada suhu kamar), kemudian tuangkan sejumlah kecil penyangga elektroforesis di atas gel, dan hati-hati menghapus sisir. Tuangkan dari buffer elektroforesis dan hati-hati menghapus rekaman itu. Gunung gel dalam tangki elektroforesis. 7. Tempatkan gel ke dalam perangkat elektroforesis dan buffer elektroforesis cukup untuk menutupi gel hingga kedalaman sekitar. 1 mm. 8. Campur sampel dengan memuat dye dengan 1:5 ransum atau 1:10. 9. Perlahan memuat campuran sampel ke dalam slot dari gel terendam menggunakan pakai mikropipet, sebuah micropipettor otomatis, atau berlarut-larut Pasteur pipet atau gelas kapiler tabung. Memuat standar ukuran ke dalam slot pada kedua sisi kanan dan kiri dari gel. 10. Tutup tutup tangki gel dan melampirkan mengarah listrik sehingga DNA akan bermigrasi menuju anoda positif (lead merah). Terapkan tegangan 1-5V/cm. Jika lead memiliki telah terpasang dengan benar, gelembung harus dihasilkan pada anoda dan katoda, dan dalam beberapa menit, biru bromofenol harus bermigrasi dari sumur ke tubuh gel. Jalankan gel sampai biru bromofenol dan FF cyanol xilena memiliki bermigrasi untuk jarak melalui sering ke og ketiga terakhir gel. 11. Ketika sampel DNA atau pewarna telah bermigrasi untuk jarak yang cukup melalui gel, mematikan arus listrik dan menghapus memimpin dan tutup dari tangki gel. Jika tidak, noda gel dengan cara merendam dalam penyangga elektroforesis atau etidium mengandung H2O bromida (0,5 mg / ml) selama 20-45 menit pada Resume of Journal suhu kamar atau dengan merendam dalam 1:10.000 -lipat pengenceran larutan stok SYBR Hijau dalam buffer elektroforesis. E. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN Kelebihan : 1. Sampel dapat dengan mudah dipulihkan dan diekstrak dari gel untuk studi lanjut. 2. Keuntungan lain adalah bahwa gel yang dihasilkan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan Kekurangan : Mungkin ada batas, tetapi tergantung pada buffer selama elektroforesis untuk menghasilkan listrik yang cocok dan untuk mengurangi panas yang dihasilkan oleh arus listrik dapat dianggap sebagai keterbatasan teknik elektroforesis
