DNA

Ukuran DNA dapat ditentukan
dengan Elektroforesis Gel
Agarosa
Elektroforesis Gel Agarosa
Gel electrophoresis merupakan teknik yang digunakan
secara luas untuk analisis DNA dan protein. agarosa
gel electrophoresis rutin digunakan untuk preparasi dan
analisis DNA.
Gel electrophoresis adalah prosedur yang memisahkan
molekul berdasarkan kecepatan gerakan melalui gel di
bawah pengaruh medan listrik.
agarosa gel electrophoresis dapat digunakan untuk
menentukan adanya dan ukuran produk PCR.
• DNA : bermuatan negatip.
• Jika ditempatkan di dalam suatu medan listrik, DNA akan bergerak ke
arah kutub positip (anoda) .
• Gel agarosa digunakan untuk memperlambat gerakan DNA dan
memisahkan berdasarkan
ukurannya.
H
O
2


DNA
-
Power
+
• Polimer agarosa berlubang,
memungkinkan gerakan DNA
Scanning Electron Micrograph
gel agarosa (1×1 µm)

Kecepatan Gerak DNA ?
Kekuatan medan listrik, buffer, densitas gel agarosa, ukuran DNA
menentukan kecepatan gerak DNA
DNA kecil bergerak lebih cepat dari pada DNA besar
…gel electrophoresis memisahkan DNA menurut ukuran
DNA
small
large
-
Power
+
Di dalam gel agarosa, DNA linear bergerak
berbanding terbalik dengan log10 bobot molekulnya.
agarosa
D-galactose
*Lina Hesse, technisi , kolega Koch yang
pertama kali menyarankan agar untuk
digunakan dalam pembiakan bakteri
3,6-anhydro
L-galactose
• gel agarosa yang manis
dimakan sejak abad 17.
•Agarosa pertama digunakan di
biologi ketika Robert Koch
menggunakannya sebagai
medium kultur untuk bakteri
Tuberculosis pada tahun 1882
Agarosa : polimer linear yang diekstrak dari rumput laut
Pembuatan Gel agarosa
agarosa gel disiapkan dg
pencampuran bubuk
agarosa dan larutan buffer
Buffer
erLenmmeyer untuk
pendidihan
agarosa
Alat Electrophoresis
Power supply
 tutup
tanki gel 
Kabel listrik

Nampan cetakan 
Sisir gel
Nampan cetakan gel & sisir
Persiapan nampan cetakan
Segel ujung nampan cetakan dan pasang sisir. Tempatkan nampan
cetakan pada permukaan datar. Sisir gel tidak boleh menyentuh
permukaan nampan.
agarosa
Larutan Buffer
Campur bubuk agarosa dan larutan buffer. Gunakan erlenmeyer dg
ukuran beberapa kali lebih besar dari volume buffer.
Pelelehan agarosa
agarosa tidak larut pada temperatur kamar (kiri).
Larutan agarosa dididihkan sapai jernih (kanan).
Aduk pelan larutan secara periodik ketika pemanasaan agar semua butiran agarosa
larut.
***Hati-hati ketika mendidihkan - lar. agarosa bisa mjd superheated dan bisa
mendidih dg hebat jiks dipanaskan terlalu lama di dalam oven microwave.
Penuangan gel
Biarkan lar. agarosa agak dingiin (~60ºC) dan kemudian tuang hatihati larutan agarosa ke dalam nampan cetakan. Hindarkan
gelembung udara.
Setiap sisir gel harus di bawah permukaan laruatn agrosa cair
Ketika dingin , tjd poimerisasi agarosa , membentuk gel lunak. Gel
kelihatan jernih jika pendinginan sempurna (30-45 minutes). Hati-hati
memindahkan sisir dan plester.
Tempatkan gel di dalam electrophoresis chamber.
DNA
buffer 

wells
Cathode
(negative)



Anode
(positive)
Tambah buffer electrophoresis secukupnya untuk menutup gel
dg kedalaman sekurang-kurangnya 1 mm. Pastikan setiap
sumur terisi buffer.
Preparasi Sampel
Campur sampel DNA dg buffer loading 6X. (w/ zat warna). Ini akan
menjadikan sampel kelihatan ketika loading pada gel, dan
menaikkan densitas sampel, sehingga tenggelam ke dasar sumur gel.
Buffer loading 6X 
 Bromophenol Blue (pewarna)
 Glycerol (pemberat)
Loading Gel
Hati-hati tempatkan ujung pipet ke sumur dan masukkan sampel
pelan. Sampel seharusnya tenggelam ke dasar sumur. Jangan
sampai gel rusak kena ujung pipet.
Runing Gel
Tempatkan tutup pada chamber electrophoresis , sambung kabel listrik,
hubungkan ke power supply. Pastikan kabel tersambung secara benar
sehingga DNA bergerak ke anoda.( merah). Jika power on, akan ada
gelembung di dalam elektrode .
Cathode
(-)
 wells
 Bromophenol Blue
DNA
(-)

Gel
Anode
(+)
Setelah arus diberikan , pastikan Gel berjalan ke arah yg benar.
Bromophenol blue akan berjalan ke arah yg sama dg arah DNA.
DNA Ladder Standard
 12,000 bp
 5,000
DNA
migration
Note: bromophenol
blue bermigrasi pada
kecep yg sama yaitu
molekul DNA 300 bp
bromophenol blue
 2,000
 1,650
 1,000
 850
 650
 500
 400
 300
 200
 100
+
Penyertaan DNA ladder (DNA yg diketahui ukurannya)
pada gel membuat mudah menentukan ukuran DNA yg
tidak diketahui ukurannya.
Pewarnaan Gel
• Etidium bromida mengikat DNA dan terjadi fluoresensi pada sinar
UV, menjadikan visualisasi DNA pada Gel.
• Etidium bromida dapat ditambahkan ke gel dan /atau running
buffer sebelum gel di run atau gel dapat diwarnai setelah di run.
***Perhatian ! Etidium bromide : mutagen kuat racun sedang.
Gunakan sarung tangan.
Alternatif yg lebih aman pengganti
Etidium Bromida
 Methylene Blue
 BioRAD - Bio-Safe DNA Stain
 Ward’s - QUIKView DNA Stain
 Carolina BLU Stain
…dll
keuntungan
Kerugian
murah
Kurang beracun
Tidak perlu sinar UV
Tidak menghasilkan limbah
Kurang sensitif
DNA yg dibutuhkan lebih banyak
Waktu lebih lama
Pewarnaan Gel
• Tempatkan gel di dalam nampan pewarnaan yg mengandung zat
warna encer hangat .
• Biarkan gel berwarna selama 25-30 menit.
• Utk menghilangkan kelebihan pewarna , biarkan gel di dalam air,
Ganti air beberapa kali.
Etidium Bromida memerlukan sinar UV utuk visualisasi
Visualisasi DNA (etidium bromida)
DNA ladder
 1
2
3
4
5
6
7
DNA ladder
8 
wells
 5,000 bp
 2,000
 1,650
 1,000
 850
 650
 500
 400
 300
 200
 100
mples 1, 4, 6 & 7 DNA
+
-
-
+
-
+
+
-
Visualisasi DNA ( Zat warna QuikVIEW )
sumur
DNA ladder

+ - - - - + + - - + - +
 2,000 bp
 1,500
 1,000
 750
 500
 250